楊麗娜 張 建 龔月生

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

纖維素（cellulose）是世界上最為豐富的可再生資源和碳水化合物。我國(guó)以農(nóng)作物秸稈為代表的纖維素類資源十分豐富，每年產(chǎn)量可達(dá)6億多噸。除反芻動(dòng)物瘤胃微生物可降解轉(zhuǎn)化一部分纖維素外，大部分纖維素難以被動(dòng)物消化利用。同時(shí)，由于耕地面積銳減和人口急劇增加，使得人畜爭(zhēng)糧的問(wèn)題愈加突出。通過(guò)微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解、利用纖維素資源已經(jīng)成為當(dāng)今飼料工業(yè)非常規(guī)資源開發(fā)研究的重點(diǎn)[1-2]。

來(lái)源于微生物的發(fā)酵產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和人們生活中，但過(guò)高的發(fā)酵成本依然制約著發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展[3]。因此，如何降低發(fā)酵成本成為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的研究熱點(diǎn)。發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高微生物產(chǎn)酶量、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的重要途徑。目前，在發(fā)酵條件優(yōu)化過(guò)程中，常使用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括單因素、正交試驗(yàn)、響應(yīng)面法等[4-6]。但考慮到影響發(fā)酵條件之間的交互作用以及優(yōu)化后的效果常使用響應(yīng)面法和正交設(shè)計(jì)。

本課題組從楊凌地區(qū)腐爛秸稈和腐殖質(zhì)土壤樣品中分離出一株耐熱、耐酸堿性強(qiáng)且產(chǎn)酶量較高的纖維素降解菌NP29,經(jīng)鑒定其屬于枯草芽孢桿菌。該酶反應(yīng)的最適pH值為4.5，最適反應(yīng)溫度為65℃,具有良好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[7]。本試驗(yàn)以菌株NP29為研究對(duì)象，采用響應(yīng)面法對(duì)主要的液體發(fā)酵因素進(jìn)行優(yōu)化，以期快速有效地確定該菌株產(chǎn)酶的最佳條件，提高其產(chǎn)酶能力。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為Bacillus subtilis NP29菌株，由本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物 5.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 ml，pH 值自然。

初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10 g、可溶性淀粉20 g、稻殼粉5 g、蛋白胨10 g、酵母提取物 10 g、K2HPO41 g、NaH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.15 g、MnSO40.000 5 g、H2O 1 000 ml，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶粗酶液的制備

取搖瓶發(fā)酵液，4℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.2.2 羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定方法

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定CMCase[8]。取經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液0.1 ml，加入已預(yù)熱至65℃的0.5%（w/v，pH值4.5）的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液0.9 ml，在65℃反應(yīng)5 min后立即加入2 ml DNS，煮沸 5 min，流水冷卻稀釋至 20 ml，540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，加熱失活的酶液作為空白對(duì)照。將在上述條件下每分鐘由底物生成1 μmol還原糖所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位，用U/ml表示。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

使用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選枯草芽孢桿菌NP29產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的重要影響因素。應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對(duì)影響菌株NP29產(chǎn)纖維素酶的9個(gè)因素進(jìn)行篩選，每個(gè)因素分別確定高（+）和低（-）兩個(gè)水平。選擇N=12的設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得多元一次回歸方程：

式中：Y——CMCase的預(yù)測(cè)值（U/ml）；

X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9分別為發(fā)酵過(guò)程中的參數(shù)；

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)中找到對(duì)CMCase活性影響最大的主要因素后，通過(guò)使主要因素同時(shí)朝響應(yīng)值增大的方向變化，找到響應(yīng)值的最大值，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以CMCase酶活性為響應(yīng)值，以主要發(fā)酵因素為自變量，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬和并對(duì)擬和方程作顯著性檢驗(yàn)及方差分析，制作響應(yīng)面和等值線。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)前面試驗(yàn)所得到的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行試驗(yàn)，將所測(cè)定的CMCase活性與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證模型的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)

利用Plackett-Burman試驗(yàn)從影響枯草芽孢桿菌NP29菌株產(chǎn)纖維素酶的9個(gè)發(fā)酵因素中篩選出顯著影響CMCase活性的主要因素。各因素及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2,各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析結(jié)果

通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到多元一次回歸方程：

該回歸模型P=0.035 1＜0.05，說(shuō)明該模型顯著。各發(fā)酵因素對(duì)Bacillus subtilis NP29產(chǎn)耐熱性纖維素酶的影響顯著性順序?yàn)椋簻囟龋究扇苄缘矸郏窘臃N比例＞胰蛋白胨＞起始pH值＞稻殼粉＞酵母提取物＞裝瓶量＞羧甲基纖維素鈉。其中，溫度與可溶性淀粉顯著影響CMCase活性（P＜0.05），接種比例對(duì)響應(yīng)值的影響雖不顯著（P=0.051 2），但仍具有較大影響，也予以考慮。因此，要提高該菌株產(chǎn)酶量，應(yīng)該提高淀粉含量和培養(yǎng)溫度，降低接種比例。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合出的方程只有在臨近最佳值的區(qū)域內(nèi)才能充分接近真實(shí)情形,因此,必須逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[9]。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)中各發(fā)酵因素對(duì)CMCase大小的正、負(fù)效應(yīng)確定其余因素的水平分別為:羧甲基纖維素鈉20 g/l、稻殼粉 5 g/l、胰蛋白胨 15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH值8.0、裝瓶量80 ml/250 ml。對(duì)淀粉含量、培養(yǎng)溫度和接種比例進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，試驗(yàn)4可達(dá)最大CMCase活性，因此以該試驗(yàn)的條件作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)

采用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行3因素3水平的中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)包括12個(gè)析因試驗(yàn)和3個(gè)中心試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行處理，確定回歸方程為：

該回歸方程的方差分析見表6，其中模型P=0.008 8＜0.05，失擬項(xiàng) P=0.120 0＞0.05，說(shuō)明該模型回歸顯著而失擬不顯著。另外，該方程回歸系數(shù)R2=0.950 8，說(shuō)明該方程的擬合程度較好，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于枯草芽孢桿菌NP29菌株產(chǎn)纖維素酶的理論預(yù)測(cè)。同時(shí)得出當(dāng)?shù)矸酆俊⑴囵B(yǎng)溫度、接種比例分別為21.44 g/l、41.07℃、1.88%時(shí)，理論最大CMCase活性為4.263 U/ml。

表6 二次多項(xiàng)模型方差分析

利用Design Expert 8.0軟件繪制的響應(yīng)面圖及等值線圖見圖1。由響應(yīng)面圖可以看出淀粉含量、培養(yǎng)溫度、接種比例之間存在交互作用，在試驗(yàn)水平內(nèi)，隨淀粉含量、培養(yǎng)溫度、接種比例的升高，CMCase活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)得出菌株NP29產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵條件是：羧甲基纖維素鈉20 g/l、稻殼粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物15 g/l、pH值8.0、裝瓶量80 ml/250 ml、淀粉21.44 g/l、接種比例1.88%、培養(yǎng)溫度41.07℃。在此條件下培養(yǎng)36 h后測(cè)定CMCase活性，3個(gè)平行試驗(yàn)的結(jié)果分別為 4.258、4.302、4.273 U/ml，平均值為4.278 U/ml，與理論預(yù)測(cè)值僅相差0.35%，可見該模型能夠很好地預(yù)測(cè)菌株NP29的產(chǎn)酶條件。

圖1 響應(yīng)面法三維曲面圖和等高線

將種子培養(yǎng)基按1.0%接種于初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)36 h后測(cè)定CMCase活性為2.021 U/ml，因此，利用響應(yīng)面法獲得的最佳產(chǎn)酶條件可使CMCase活性提高111.68%。

3 結(jié)論與討論

纖維素酶在飼料、食品、紡織、釀造、化工等諸多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，對(duì)解決能源危機(jī)、食物短缺、環(huán)境污染等具有重大的現(xiàn)實(shí)意義[10-11]。隨著纖維素酶用量的不斷增加，纖維素酶生產(chǎn)呈現(xiàn)良好的上升勢(shì)頭。但目前發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵成本過(guò)高嚴(yán)重制約著纖維素酶的進(jìn)一步應(yīng)用。為了提高纖維素酶的產(chǎn)量，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)，使得發(fā)酵技術(shù)不斷提高，發(fā)酵工藝不斷改善。

響應(yīng)面法是用來(lái)對(duì)受多個(gè)變量影響的響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化的一種回歸分析方法,具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高,又能研究幾個(gè)因素間交互作用[12]等優(yōu)點(diǎn)。目前,利用該方法對(duì)不同微生物的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,均不同程度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。張歡等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化HA-A38菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基,結(jié)果顯示菌體濃度增加了近1倍。唐志紅等[14]利用該方法優(yōu)化YDX-1菌株的發(fā)酵條件,纖維素酶活性提高了81.97%。顧芮萌等[15]使用響應(yīng)面法優(yōu)化粗糙脈孢菌的液體培養(yǎng)基,使FPA活性提高了2.03倍,CMCase活性提高了1.88倍,木聚糖酶活性提高了1.86倍,葡萄糖苷酶活性提高了2.08倍。這表明，響應(yīng)面法是一種科學(xué)、合理的優(yōu)化響應(yīng)值的方法。

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌NP29菌株產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件,用以提高該菌株的產(chǎn)酶量。研究結(jié)果表明,淀粉含量、培養(yǎng)溫度和接種比例是影響該菌株纖維素酶產(chǎn)量的最重要的三個(gè)因素。而通過(guò)最陡爬坡法和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到了最佳的發(fā)酵條件,即羧甲基纖維素鈉 20 g/l、稻殼粉5 g/l、胰蛋白胨15 g/l、酵母提取物 15 g/l、pH 值 8.0、裝瓶量 80 ml/250 ml、淀粉含量21.44 g/l、接種比例1.88%、培養(yǎng)溫度41.07℃。在此條件下獲得的纖維素酶活性較優(yōu)化前提高了111.68%。