李 嬌 伍國(guó)華 侯永清 王 蕾 丁斌鷹 朱惠玲 劉玉蘭

(武漢工業(yè)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023)

腸黏膜是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是防御腸道內(nèi)微生物及致炎因子入侵的主要門(mén)戶(hù),維護(hù)腸黏膜的健康具有重要意義。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要致病成分，能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)和活性氧族(ROS)等特異性致炎細(xì)胞因子,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[1]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)為硫醇類(lèi)化合物、巰基供給劑，在試驗(yàn)中及臨床上都已得到廣泛的應(yīng)用[2]。NAC具有多種藥理作用，它可以調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞凋亡程序，減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，清除自由基。研究表明，NAC可減輕輻射損傷相關(guān)腸屏障功能障礙(腸黏膜損傷、萎縮，腸通透性增加和內(nèi)毒素異位等)[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，NAC能降低門(mén)靜脈內(nèi)毒素水平，改善梗阻性黃疸大鼠腸道屏障功能，有效減輕腸道黏膜的損傷[4]。但目前有關(guān)NAC的應(yīng)用研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域或試驗(yàn)動(dòng)物上，在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用報(bào)道很少。本試驗(yàn)采用脂多糖(LPS)刺激仔豬建立腸道受損模型，研究NAC對(duì)LPS刺激導(dǎo)致的腸道損傷是否具有緩解作用，為NAC的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

N-乙酰半胱氨酸(NAC，市售醫(yī)藥級(jí)產(chǎn)品，純度≥99.0%)、大腸桿菌脂多糖（LPS，大腸桿菌血清型055:B5，Sigma公司產(chǎn)品）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

選取24頭來(lái)源一致健康仔豬 [杜洛克×長(zhǎng)白×大白，體重（7.63±0.15）kg]，按單因子設(shè)計(jì)隨機(jī)分配到4個(gè)處理組：①空白對(duì)照組、②LPS組、③0.025%NAC組、④0.05%NAC組。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。處理①和②組飼喂基礎(chǔ)日糧，處理③和④組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.025%NAC和0.05%NAC。試驗(yàn)期為17 d。試驗(yàn)第17 d處理②、③、④組仔豬按照100 μg/kg BW的劑量腹膜注射LPS，處理①組注射等量的生理鹽水。注射LPS或生理鹽水6 h后，仔豬注射50 mg/kg BW戊巴比妥鈉，待完全麻醉后屠宰。

1.3 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧配制參照NRC（1998）豬的營(yíng)養(yǎng)需要（8～20 kg），日糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間豬舍溫度保持在22～25℃。在不銹鋼代謝籠中飼養(yǎng)試驗(yàn)豬，鴨嘴式飲水器自動(dòng)供水，自由采食，豬舍定期清掃和消毒。

1.5 腸道樣品采集及處理

仔豬屠宰后剖開(kāi)腹腔取十二指腸、空腸和回腸，將三段腸從其腸系膜處取下并立即置于冰上。十二指腸是取胃和膽管在小腸開(kāi)口處之間的部分，組織取樣距胃賁門(mén)5 cm處；空腸是十二指腸和回腸間的部分，于空腸的1/2處取樣；回腸是回盲瓣和結(jié)腸間的部分，于回腸的1/2處取樣，所取腸段均為10 cm左右。用剪刀輕輕剖開(kāi)腸段，并用冷凍生理鹽水輕輕沖洗腸壁內(nèi)容物，用濾紙吸干水分，而后用載玻片刮取腸黏膜[5]，分裝在無(wú)菌的凍存管中，并立即在液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 小腸黏膜蛋白（TP）、DNA和RNA的含量

腸黏膜勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，再稀釋到濃度為1%，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[6]。DNA濃度用紫外可見(jiàn)分光光度法[7]測(cè)定。RNA濃度通過(guò)測(cè)定232 nm和260 nm處的吸光度值，用F1eck-Begg[8]公式算出。 DNA、RNA和蛋白質(zhì)濃度分別乘以黏膜重量即為DNA、RNA和蛋白質(zhì)在腸黏膜中的總量。

1.6.2 小腸黏膜二糖酶活性

十二指腸、空腸和回腸黏膜稱(chēng)重后，用冰凍的生理鹽水稀釋?zhuān)?0∶1，v/w），再用勻漿器冰上勻漿，14 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶偶聯(lián)法（葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法）測(cè)定[9]。

酶活力單位定義：37℃下每分鐘分解1.0 μmol/l底物為1個(gè)酶活力單位，單位為μmol底物/min或U。

二糖酶活力＝X×n/60×a

式中：X——反式所釋放的葡萄糖（μmol/l）；

a——二糖中葡萄糖釋放量，麥芽糖為2，蔗糖和乳糖為1；

n——樣品稀釋倍數(shù)；

60——反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.6.3 空腸黏膜occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量

采用Western blot方法測(cè)定。取約0.1 g空腸黏膜,加入0.5～1 ml冷Lysis Buffer(凱基全蛋白提取試劑盒),勻漿，在 12 000 ×g、4 ℃下離心 15 min,上清液即為全蛋白提取物。然后用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)量吸光度,求出總蛋白濃度,根據(jù)此濃度配成等蛋白濃度溶液。用2×SDS上樣緩沖液按1∶1稀釋待測(cè)蛋白樣品,于100℃煮沸5 min,然后垂直電泳分離。分離膠濃度10%,電泳結(jié)束后,半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,室溫5%脫脂奶粉封閉1 h,洗膜后孵occludin(Invitrogen公司)和β-actin,4℃過(guò)夜,洗膜后孵二抗,室溫下孵育1.5 h。再次洗膜后用ECL發(fā)光試劑（Pierce公司）顯影，用Alpha Innotech成像系統(tǒng)軟件分析occludin蛋白相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果以occludin蛋白與內(nèi)參的灰度比值表示。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's法多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

小腸各段DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值的影響

由表2可知，與空白的對(duì)照組相比，LPS組空腸黏膜的DNA含量顯著下降（P＜0.05）；空腸黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均顯著提高（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組空腸黏膜的DNA含量顯著提高（P＜0.05），RNA/DNA 比值顯著降低（P＜0.05）；0.05%NAC組空腸黏膜RNA/DNA和TP/DNA比值均顯著降低（P＜0.05）。其他各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響（見(jiàn)表 3）

表3 NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響（U/mg prot.）（n=6）

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組空腸麥芽糖酶、十二指腸和空腸乳糖酶活性顯著下降（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組十二指腸乳糖酶活性顯著提高（P＜0.05）；0.05%NAC組空腸麥芽糖酶、十二指腸和空腸乳糖酶活性均顯著提高（P＜0.05）。其他指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 NAC對(duì)LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對(duì)表達(dá)量的影響（見(jiàn)圖1）

圖1 NAC對(duì)LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，LPS組空腸黏膜occludin相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與LPS組相比，0.025%NAC組和0.05%NAC組空腸黏膜occludin相對(duì)表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。

3 討論

3.1 添加NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)的本質(zhì)是細(xì)胞數(shù)目的增加和細(xì)胞體積的增大。DNA含量、RNA/DNA和TP/DNA比值可以作為腸黏膜細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的生化指標(biāo)。DNA含量是細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)，RNA含量的增大通常意味著蛋白質(zhì)合成的增加。RNA/DNA比值能比較準(zhǔn)確反映細(xì)胞大小增加的情況[10]。TP/DNA比值可作為衡量細(xì)胞肥大程度的指標(biāo)，反映細(xì)胞的大小[11]。

LPS刺激能降低空腸黏膜DNA含量，這與張偉[12]的研究結(jié)果類(lèi)似。而添加NAC后DNA含量明顯提高，這說(shuō)明NAC對(duì)LPS刺激導(dǎo)致的腸黏膜細(xì)胞數(shù)量減少有緩解作用，進(jìn)而對(duì)腸黏膜產(chǎn)生了保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是抑制過(guò)氧化物造成的DNA斷裂和化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，修復(fù)受損的DNA[13]。NAC的這種修復(fù)作用可以保護(hù)細(xì)胞免于DNA損傷引起的死亡[14]。試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，導(dǎo)致空腸黏膜RNA/DNA、TP/DNA比值提高，NAC能使比值降低，這可能是因?yàn)樘幱趹?yīng)激狀態(tài)下，腸黏膜細(xì)胞在受損時(shí)，表現(xiàn)為細(xì)胞的活性增強(qiáng)，病理性腫脹，單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)效率加快，代償性代謝旺盛，負(fù)荷過(guò)重所致，添加NAC能較好地緩解這種病理性變化。

3.2 添加NAC對(duì)LPS刺激仔豬小腸黏膜二糖酶活性的影響

在動(dòng)物體內(nèi)，碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶是小腸二糖酶。二糖酶是小腸絨毛刷狀緣上的主要蛋白質(zhì)[15]，小腸黏膜上皮細(xì)胞的數(shù)量始終處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程中，二糖酶就是來(lái)自脫落的腸黏膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞脫落崩解后釋放二糖酶。二糖酶活性大小可衡量腸道黏膜上皮細(xì)胞發(fā)育程度和功能強(qiáng)弱[16]。多糖和寡糖需先在消化酶的作用下形成二糖，再經(jīng)二糖酶分解成單糖后才能被吸收[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加NAC對(duì)LPS刺激導(dǎo)致十二指腸乳糖酶、空腸麥芽糖酶和乳糖酶活性的降低有一定的緩解作用。研究表明，LPS刺激宿主細(xì)胞表達(dá)活性氧族（ROS）等細(xì)胞因子，ROS作為NADPH氧化酶產(chǎn)生的第二信使參與炎癥反應(yīng)[18]。NAC可以抑制細(xì)胞中NADPH氧化酶活性，進(jìn)而抑制LPS刺激細(xì)胞因子（TNF-α和ROS）的表達(dá)，阻斷LPS的作用通路，從而使小腸黏膜細(xì)胞不斷更新，二糖酶的分泌釋放恢復(fù)正常。

3.3 添加NAC對(duì)LPS刺激仔豬空腸黏膜occludin相對(duì)表達(dá)量的影響

內(nèi)毒素通過(guò)腸黏膜的主要途徑是經(jīng)腸黏膜細(xì)胞間緊密連接直接透過(guò)細(xì)胞膜，而位于腸上皮的緊密連接對(duì)維持腸黏膜的屏障功能至關(guān)重要[19]，occludin是細(xì)胞間緊密連接的特征性蛋白，可以直接反映緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，occludin蛋白對(duì)維持腸黏膜屏障功能起至關(guān)重要的作用，其表達(dá)可改變腸黏膜通透性[20]。體外研究試驗(yàn)證實(shí)，TNF-α能降解緊密連接蛋白[21-22]，抑制occludin的表達(dá)[23]，增加腸道上皮細(xì)胞的通透性。

在本試驗(yàn)中，日糧中添加NAC緩解了LPS刺激導(dǎo)致的空腸黏膜細(xì)胞間occludin表達(dá)下降，這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致[24]，說(shuō)明NAC可能通過(guò)抑制LPS引起的細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)occludin的表達(dá)，進(jìn)而修復(fù)細(xì)胞間緊密連接，改善腸道屏障功能、緩解腸道損傷。

4 結(jié)論

LPS刺激損傷仔豬腸道黏膜，導(dǎo)致DNA含量減少、二糖酶活性降低和occludin表達(dá)量降低，日糧中添加0.025%或0.05%NAC對(duì)LPS刺激所導(dǎo)致的腸道損傷有緩解作用。