秦懷洲，張治國，吳琳，王舉磊，李立宏，高國棟#（.第四軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安70038；.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，西安 7003）

神經(jīng)母細胞瘤是神經(jīng)外科臨床常見而難治的原發(fā)性腫瘤，目前其治療主要應(yīng)用手術(shù)切除再輔以常規(guī)放療或化療，患者預(yù)后情況普遍較差[1]。研究認為，以姜黃素為主要活性成分的姜黃，具有抗炎、抗氧化、抗HIV病毒等多種作用。已有研究表明，姜黃素對鼻咽癌[2]和宮頸癌[3]等多種腫瘤具有抑制作用。但目前姜黃素對抗神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的作用及其機制研究較少，其對神經(jīng)母細胞瘤的作用尚未見報道。筆者擬通過觀察姜黃素促進神經(jīng)母細胞瘤凋亡作用，進一步了解姜黃素對腫瘤細胞侵襲能力的影響，探討其抗神經(jīng)母細胞瘤的作用機制，并為多手段治療該腫瘤打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX260型熒光顯微鏡、CK30型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Sunrise RC+TW型遙控酶標(biāo)分析儀（奧地利Tecan公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司），2406-2型CO2培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）。

1.2 試藥

姜黃素、MTT、順鉑、Annexin V/PI雙標(biāo)試劑盒、Hoechst33258試劑盒均購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞瘤

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5 Y細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所。

2 方法

2.1 MTT法測定細胞存活率

取對數(shù)生長期的細胞，傾出其培養(yǎng)液，用PBS洗細胞3次，加適量的胰蛋白酶消化并細胞計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整至104個/mL。細胞懸液按每孔200 μL加入96孔培養(yǎng)板。姜黃素用75%的乙醇溶解配成母液，使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。將姜黃素設(shè)定6個濃度：1.25、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol·L－1，即姜黃素①、②、③、④、⑤、⑥組；每種藥物濃度接種5個復(fù)孔，每個濃度設(shè)陰性對照組（培養(yǎng)液中只有細胞，無藥物）和空白對照組（培養(yǎng)液中只有等量的藥物，無細胞）。細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換成含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，37℃、50 mL·L－1CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后取出全部培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液（5 g·L－1）20 μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10min，使沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定吸光度，計算腫瘤細胞存活率：細胞存活率（%）＝（用藥組吸光度值－空白對照組吸光度值）/（陰性對照組吸光度值－空白對照組吸光度值）×100%。

2.2 流式細胞儀分析細胞凋亡

根據(jù)Annexin V/PI雙標(biāo)試劑盒說明，用雙蒸水1∶4稀釋結(jié)合緩沖液，PBS洗滌樣品細胞后，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×105個/mL。姜黃素設(shè)定4個濃度：5.0、10.0、15.0、20.0μmol·L－1，即姜黃素①、②、③、④組。取195μL細胞懸液，加入5μL Annexin V混勻，室溫反應(yīng)10 min，PBS洗細胞1次，再以190 μL稀釋的結(jié)合緩沖液重懸，加10 μL 20 μg·mL－1PI，用流式細胞儀分析，并計算凋亡細胞百分比。試驗另設(shè)陽性對照（3 μg·mL－1順鉑）和陰性對照。

2.3 Hoechst33258熒光染料染色觀察細胞核形態(tài)的改變

姜黃素設(shè)定4個濃度：5.0、10.0、15.0、20.0 μmol·L－1，即姜黃素①、②、③、④組。藥物處理后的細胞用PBS洗滌并重懸，加入濃度為5 μg·mL－1的Hoechst33258熒光染料反應(yīng)10 min，于熒光顯微鏡下觀察。觀察細胞核形態(tài)，以細胞萎縮、核固縮、染色質(zhì)凝聚和熒光強度增強等作為凋亡細胞指征。試驗另設(shè)陽性對照（3 μg·mL－1順鉑）和陰性對照。

2.4 SH-SY5Y細胞體外侵襲能力的測定

Transwell小室為一杯狀結(jié)構(gòu)，杯孔直徑6.5mm；杯底由8.0 μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜封閉。濾膜內(nèi)表面均勻涂人工重構(gòu)基底膜材料基質(zhì)膠約50 mg·L－1，包被后水化基底膜。將制備好的小室4℃風(fēng)干，用紫外線照射2 h殺菌，使用前加入少量無血清的培養(yǎng)基水化。各組分別處理SH-SY5 Y細胞后，小室內(nèi)加入100 μL腫瘤細胞懸液，細胞密度為105 mL，培養(yǎng)液為含10 g·L－1的BSA無血清培養(yǎng)液，Transwell小室加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h后取出濾膜，PBS液淋洗，用棉簽擦去濾膜上層的細胞，95%酒精固定，4 g·L－1結(jié)晶紫溶液染色。計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取每個視野的平均數(shù)表示腫瘤細胞的侵襲能力。試驗設(shè)陽性對照（3 μg·mL－1順鉑）和陰性對照。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對SH-SY5Y細胞生長的抑制作用

MTT試驗檢測細胞存活率（重復(fù)3次試驗得到相似的結(jié)果），并繪制細胞生存曲線。結(jié)果表明，姜黃素能抑制SH-SY5 Y 細胞的生長，且半數(shù)抑制濃度（IC50）為 15 μmol·L－1。姜黃素對SH-SY5 Y細胞生長的抑制作用見圖1。

圖1 姜黃素對SH-SY5Y細胞生長的抑制作用Fig 1 Inhibition effect of curcumin on the growth of SH-SY5Y

3.2 姜黃素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

由流式細胞儀分析結(jié)果可知，姜黃素各濃度組均出現(xiàn)了明顯的亞二倍體凋亡峰，各組的凋亡細胞百分比與陰性對照比較，有顯著性差異（P＜0.01）。不同濃度姜黃素對SH-SY5 Y細胞凋亡的影響見表1。

3.3 姜黃素對細胞形態(tài)學(xué)的影響

隨著藥物濃度的增加，與陰性對照組比較，姜黃素各組中SH-SY5 Y細胞數(shù)量逐漸減少。姜黃素處理48h后，經(jīng)Hoechst33258熒光染料染色，可見具有凋亡征象的腫瘤細胞，細胞變圓、變小、收縮，胞核深染、固縮，細胞質(zhì)也出現(xiàn)收縮現(xiàn)象。正常細胞則細胞膜完整、光滑，細胞核正常。

表1 不同濃度姜黃素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響（±s）Tab 1 Effects of different concentrations of curcumin on the apoptosis of SH-SY5Y（±s）

表1 不同濃度姜黃素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響（±s）Tab 1 Effects of different concentrations of curcumin on the apoptosis of SH-SY5Y（±s）

與陰性對照組比較：＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.01

組別陰性對照組陽性對照組姜黃素①組姜黃素②組姜黃素③組姜黃素④組濃度/μmol·L－1- - 5101520 n 333333凋亡細胞百分比5.22±1.6862.63±5.21＊16.87±4.25＊29.90±2.95＊45.77±5.65＊61.53±4.91＊

3.4 姜黃素對SH-SY5Y細胞侵襲能力的影響

陰性對照組細胞均能夠穿過鋪有人工重構(gòu)基底膜材料的基質(zhì)膠，姜黃素各組穿膜細胞數(shù)均少于陰性對照組（P＜0.01），且隨姜黃素濃度升高，穿膜細胞數(shù)明顯減少。姜黃素④組與陽性對照組比較，穿膜細胞數(shù)無顯著性差異。不同濃度姜黃素對SH-SY5 Y細胞穿膜數(shù)量的影響見表2。

4 討論

本試驗以SH-SY5 Y細胞為研究對象，結(jié)果隨著劑量的增加，細胞生存率顯著降低，SH-SY5 Y細胞的生存曲線顯示其生長明顯受到抑制，說明姜黃素能明顯抑制該腫瘤細胞生長。Hoechst33258熒光染色結(jié)果也表明，姜黃素可促進SH-SY5 Y細胞的凋亡，并使細胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變。Transwell細胞侵襲能力試驗發(fā)現(xiàn)，隨著姜黃素作用濃度的增加，腫瘤細胞的侵襲能力逐漸下降，這與近期國外一項研究顯示的姜黃素能降低結(jié)腸癌的侵襲能力一致[4]。提示姜黃素具有減少神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的作用。這些數(shù)據(jù)可為姜黃素治療神經(jīng)母細胞瘤提供依據(jù)，也可為多途徑綜合治療神經(jīng)母細胞瘤提供策略，但其具體作用機制還需進一步研究。

表2 不同濃度姜黃素對SH-SY5Y細胞穿膜數(shù)量的影響（±s）Tab 2 Effects of different concentrations of curcumin on the number of passed membrane SH-SY5Y（±s）

表2 不同濃度姜黃素對SH-SY5Y細胞穿膜數(shù)量的影響（±s）Tab 2 Effects of different concentrations of curcumin on the number of passed membrane SH-SY5Y（±s）

與陰性對照組比較：＊P＜0.01vs.negative control group：＊P＜0.01

組別陰性對照組陽性對照組姜黃素①組姜黃素②組姜黃素③組姜黃素④組濃度/μmol·L－1--5101520 n 333333穿膜細胞數(shù)（個/孔）197.0±9.862.7±6.8＊164.3±12.1＊133.7±4.2＊100.0±10.5＊64.7±7.8＊

[1]Saulnier SG，Bergendahl GM，Brard L，et al.Aphase 1 study of nifurtimox in patients with relapsed/refractory neuroblastoma[J].J Pediatr Hematol Oncol，2011，33（1）：25.

[2]Wong TS，Chan WS，Li CH，et al.Curcumin alters the migratory phenotype of nasopharyngeal carcinoma cells through up-regulation of E-cadherin[J].Anticancer Res，2010，30（7）：2851.

[3]Singh M，Singh N.Curcumin counteracts the proliferative effect of estradiol and induces apoptosis in cervical cancer cells[J].Mol Cell Biochem，2011，347（1-2）：1.

[4]Nautiyal J，Banerjee S，Kanwar SS，et al.Curcumin enhances dasatinib-induced inhibition of growth and transformation of colon cancer cells.[J].Int J Cancer，2011，128（4）：951.