李強(qiáng)，佟麗，謝揚(yáng)（1.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州510515；.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州510515）

過山楓（Celastrus aculeatus Merr.）為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，藥用部位為根和藤莖，具有祛風(fēng)除濕、行氣活血、消腫解毒等功效，我國民間長期使用過山楓來治療風(fēng)濕痹痛等證[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，過山楓乙醇提取物具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和免疫調(diào)節(jié)作用[2，3]。補(bǔ)體系統(tǒng)非正常激活會引起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[4，5]。天然產(chǎn)物中多糖類補(bǔ)體抑制劑的研究和開發(fā)備受到國內(nèi)、外學(xué)者的廣泛關(guān)注[6]。Zhu HW等[7]和Xu H等[8]對杜仲、柴胡多糖的研究表明，其具有抗補(bǔ)體活性作用。目前，國內(nèi)、外仍未見關(guān)于過山楓多糖（CAP）藥理作用研究的報道。本研究首次制備CAP，并對其理化性質(zhì)和抗補(bǔ)體活性做初步探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eppendoff 5810 R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendoff公司）；TECAN GENios Pro型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；CHB-100型恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆籒icolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥

過山楓根和藤莖采自廣州市增城區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院華南植物研究所葉華谷研究員鑒定為真品，樣本保留在中國科學(xué)院華南植物研究所樣本館，編號為10943?？咕d羊紅細(xì)胞抗體（溶血素，效價為1∶4000，浙江玉環(huán)縣南方試劑廠）；肝素鈉（廣州斯佳生物科技有限公司，含量：150 μg·mg－1）；三蒸水、去離子水為筆者自制；其余試劑均為分析純。

1.3 動物與細(xì)胞

豚鼠2只，♂，體重500～700 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2006-0015）。綿羊紅細(xì)胞（浙江玉環(huán)縣南方試劑廠）。

2 方法

2.1 CAP的制備

干燥的過山楓藤莖粉末（200 g）依次用丙酮、甲醇索式提取各12 h，脫脂。倒出殘留物，于50℃干燥24 h。加10倍量水于干燥的過山楓殘留物中，80℃提取3次，每次3 h。抽濾，濾液合并減壓濃縮，濃縮液10000 r·min－1離心10 min，取上清液加4倍量95%乙醇4℃靜置過夜，3000 r·min－1離心5 min后，沉淀重復(fù)水溶醇沉步驟2次。沉淀用去離子水復(fù)溶，用Sevage試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）去蛋白4次，水溶液部分裝入透析袋（截留分子量：3500 Da），在去離子水中4℃透析48 h，透析液冷凍、干燥，獲得CAP。

2.2 CAP的理化性質(zhì)

2.2.1 CAP中多糖的含量測定 按苯酚-硫酸法測定，精密稱取無水葡萄糖54 mg，溶于去離子水中并定容至500 mL，分別吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，加水稀釋至2.0 mL后，依次加入6%苯酚1.0 mL和濃硫酸5.0 mL。靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm波長處測定吸光度，取2.0 mL去離子水按同法顯色作為空白，以葡萄糖濃度（x，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取CAP 5.8mg，去離子水溶解，并定容至50mL。取CAP溶液1.0 mL，按上述步驟操作，測定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

2.2.2 CAP的波譜分析 取CAP 2 mg，與KBr研磨混合后，經(jīng)壓片機(jī)壓成透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描分析，以KBr空白片作參比，掃描范圍4000～400 cm－1。取CAP近飽和溶液，以蒸餾水為空白對照，于紫外-可見光譜205～400 nm波長區(qū)域掃描。

2.3 豚鼠補(bǔ)體效價測定

取一定量豚鼠血清，加入明膠巴比妥（GVB2+）緩沖液制備成1∶20濃度的溶液，并依次對倍稀釋為1∶40～1∶640濃度的溶液。取稀釋好的豚鼠血清0.1 mL，與等體積溶血素和綿羊紅細(xì)胞混勻，不足部分以GVB2+緩沖液補(bǔ)至0.6 mL。37℃金屬浴30 min，4℃下4000 r·min－1離心10 min，取上清液在570 nm波長處測定吸光度。以0.1 mL綿羊紅細(xì)胞與0.5 mL GVB2+緩沖液組成空白管的吸光度作為0%溶血，以0.1 mL綿羊紅細(xì)胞與0.5 mL三蒸水組成的全溶血管的吸光度作為100%溶血，計算每管溶血百分率，并制備溶血曲線。根據(jù)試驗結(jié)果確定豚鼠血清補(bǔ)體效價。選擇合適的稀釋度的豚鼠血清進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.4 CAP的抗補(bǔ)體活性

分別取0.l mL稀釋度為1∶2～1∶64的CAP溶液與等體積的適宜稀釋度的豚鼠血清、溶血素和5%綿羊紅細(xì)胞混合，不足部分以GVB2+緩沖液補(bǔ)至0.6 mL，其余部分按“2.3”項下方法操作。以肝素溶液為陽性對照。按如下公式計算溶血率，并繪制溶血曲線：

溶血率＝Ac－（As－Ap）/Ac×100%

式中，As為加多糖樣品溶液的溶血體系在570 nm波長處的吸光度；Ap為不同稀釋度的CAP與GVB2+緩沖液的對照在570 nm波長處的吸光度；Ac為GVB2+緩沖液、血清和致敏綿羊紅細(xì)胞的上清液在570 nm波長處的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 CAP的性狀和多糖含量

過山楓經(jīng)脫脂，水提醇沉，Sevage法去蛋白，冷凍、干燥獲得一種桔紅色絮狀固體物質(zhì)，即CAP。用不同濃度的葡萄糖溶液經(jīng)苯酚-硫酸法檢測其吸光度，獲得的回歸方程為y＝0.016 x－0.0038（r＝0.9997）。CAP經(jīng)苯酚-硫酸法檢測其多糖含量為58.3%。

3.2 CAP的波譜分析

在260 nm波長處沒有吸收峰，表明CAP中無核酸；而在280nm波長處有一個肩峰，表明CAP是與蛋白質(zhì)復(fù)合的多糖。3383.6 cm－1處寬而強(qiáng)的吸收峰代表了羥基的伸縮振動；2933.5 cm－1處弱的吸收峰是由于C-H的伸縮振動和彎曲振動造成的；在1646.8cm－1處為水的振動吸收峰；在1200～1000 cm－1的區(qū)域為吡喃環(huán)的醚鍵（C-O-C）和羥基的變角振動吸收峰；1021.9、1078.8、1154.8 cm－1是α-吡喃糖的特征吸收峰，934.7 cm－1處吸收峰為α-D-Glcp的特征吸收峰，847.5 cm－1吸收峰為α-端基差向異構(gòu)的C-H變角振動[9]。這說明，CAP主要由α-吡喃糖構(gòu)成，含有α-D-Glcp。CAP的紫外-可見光譜見圖1；CAP的紅外光譜見圖2。

圖1 CAP的紫外-可見光譜Fig 1 UV visible spectrum of CAP

3.3 補(bǔ)體效價的測定

在補(bǔ)體稀釋濃度為1∶40時，體系基本達(dá)到全溶血，在1∶80時，溶血率開始下降。所以選擇補(bǔ)體稀釋濃度為1∶40，確保體系能夠全部溶血。不同稀釋倍數(shù)的補(bǔ)體溶血率曲線見圖3。

3.4 CAP對補(bǔ)體的作用

圖2 CAP的紅外光譜Fig 2 IR spectrum of CAP

圖3 不同稀釋倍數(shù)的補(bǔ)體溶血率曲線Fig 3 Hemolysis rate curves of various dilutions of complement

CAP稀釋濃度為1∶4時仍能完全抑制溶血，在1∶4～1∶32（濃度為913～114 μg·mL－1）范圍內(nèi)產(chǎn)生突躍達(dá)到基本完全溶血。經(jīng)計算，不同稀釋倍數(shù)的補(bǔ)體溶血率曲線的半數(shù)溶血濃度（CH50）為302 μg·mL－1，而肝素的 CH50為699 μg·mL－1。不同稀釋倍數(shù)的補(bǔ)體溶血率曲線的抗溶血活性遠(yuǎn)大于肝素。不同濃度的CAP和肝素對補(bǔ)體溶血體系的影響見圖4。

圖4 不同濃度的CAP和肝素對補(bǔ)體溶血體系的影響Fig 4 Effect of various concentrations of CAP and heprin on hemolysis system of complement

4 討論

由于CAP本身具有顏色，造成最終體系的吸光度實際是由溶血吸光度和CAP吸光度兩部分構(gòu)成。為了消除這一影響，將不同稀釋度的CAP與緩沖液混合，同樣金屬浴離心測吸光度作對照。在計算溶血百分率時，先將CAP的吸光度從體系中扣除然后計算。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫疾病的發(fā)生、傳導(dǎo)與補(bǔ)體過度激活有關(guān)，而補(bǔ)體亢進(jìn)也在許多疾病中作為重要診斷指標(biāo)，但目前市場上沒有針對補(bǔ)體的抗炎癥藥物。補(bǔ)體抑制劑的研究越來越受到關(guān)注，大量文獻(xiàn)表明，許多天然產(chǎn)物能有效地阻止補(bǔ)體激活，其成分主要存在于多糖、黃酮類和三萜類中[6]。其中多糖類生藥來源充足，可以從中尋找到無毒或低毒、廉價的抗補(bǔ)體藥物。已報道具有抗補(bǔ)體活性的杜仲多糖EWDS-2的CH50值為282 μg·mL－1[7]，柴胡多糖D3-S1的CH50值為479 μ g·mL－1[8]，而CAP的CH50值介于兩者之間，CAP抗溶血作用強(qiáng)于肝素，是一種潛在的抗補(bǔ)體藥物。CAP抗補(bǔ)體作用的位點和CAP多糖的一級結(jié)構(gòu)表征還有待進(jìn)一步研究。

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