任進(jìn)民，孫 倩，殷立新，王川平，張志清，王淑梅（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊 050000）

瑞格列奈（Repaglinide）為新型的短效口服促胰島素分泌降糖藥，耐受性強(qiáng)、安全性高，是較理想的口服降糖藥。臨床用于治療2型糖尿病，特別是合并腎功能不全的患者[1]。關(guān)于生物樣品中瑞格列奈含量的測定，已有文獻(xiàn)報(bào)道主要使用高效液相色譜（HPLC）法[2～5]，液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法[6]則很少。筆者建立了LC-MS法測定人血漿中瑞格列奈濃度的方法，并對(duì)國產(chǎn)與進(jìn)口瑞格列奈片的人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 儀器

API 4000型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)軟件（美國ABI公司）；Prominence LC-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱（日本島津公司）；AG-135分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TG16-WS型離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；GZ-20G-Ⅱ型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SB3200型超聲波清洗儀（上海音波聲電科技公司）；ZH-2型混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.2 試藥

瑞格列奈對(duì)照品（批號(hào)：100753-200501）、格列齊特對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：0269-9701）均購自中國食品藥品檢定研究院，含量均＞99.9%；受試制劑：瑞格列奈片（北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司研制，規(guī)格：每片0.5 mg（A1），批號(hào)：S20090601；規(guī)格：每片1 mg（A2），批號(hào)：S20090604）；參比制劑：瑞格列奈片（R，丹麥諾和諾德公司（Novo Nordisk A/S，規(guī)格：每片1 mg，批號(hào)：XM70002）；甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×50 mm，5 μm），保護(hù)柱C18（4.0 mm×3.0 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（90∶10）；流速：0.5 mL·min－1；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

離子源：電噴霧離子化（ESI）源；噴霧電壓：4500 V；霧化溫度：450 ℃；霧化氣：30 L·min－1；簾氣：20 L·min－1；碰撞氣：8 L·min－1；輔助氣：35 L·min－1；檢測方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；監(jiān)測離子：m/z 454.4→231.5（瑞格列奈），m/z 324.1→127.2（內(nèi)標(biāo)，格列齊特）；碰撞誘導(dǎo)解離電壓：40 V（瑞格列奈）和20 V（格列齊特）；駐留時(shí)間（Dwell time）：100 ms。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確稱取瑞格列奈對(duì)照品25.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度為1 mg·mL－1的對(duì)照品貯備液。以空白血漿稀釋至1.0 μg·mL－1，混勻，作為對(duì)照品工作樣品。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液。準(zhǔn)確稱取格列齊特對(duì)照品10.05 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為內(nèi)標(biāo)貯備液。精密吸取100 μL置250 mL容量瓶中，用甲醇定容，得400 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 血樣處理

精密吸取100 μL血漿（標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品取健康志愿者空白血漿制備）中依次加入內(nèi)標(biāo)溶液（400 ng·mL－1格列齊特的甲醇溶液）100 μL、甲醇1 mL，渦流混合30 s，離心（11000 r·min－1）5 min后，取上清液200 μL裝入自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶，取樣20 μL進(jìn)行分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)與基質(zhì)效應(yīng)

2.4.1 專屬性考察。瑞格列奈和內(nèi)標(biāo)格列齊特的ESI一級(jí)全掃描質(zhì)譜主要生成準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，分別為m/z 454.4和m/z 324.1。選擇性對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，將各待測物及內(nèi)標(biāo)物生成的主要碎離子用于定量分析時(shí)監(jiān)測的產(chǎn)物離子。瑞格列奈和內(nèi)標(biāo)格列齊特生成的主要碎片離子為m/z 231.5和m/z 127.2。分別取6名受試者的空白人血漿100 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外（以甲醇代替），按“2.3”項(xiàng)下方法操作；將相應(yīng)的瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中制備200 ng·mL－1的血漿模擬樣品，按同法操作；另取志愿受試者用藥0.1 h后的血漿樣品100 μL，按同法操作。由血漿樣品按本法分離測定所得的色譜圖表明，空白樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾瑞格列奈的分析，通過與空白血樣添加標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（瑞格列奈、格列齊特）色譜圖比較，確證瑞格列奈和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為1.8、1.5 min。色譜圖見圖1。

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)考察。取對(duì)照品貯備液適量，用甲醇適當(dāng)稀釋，分別取0.1 mL，加入空白血漿基質(zhì)溶液0.9 mL，制備低、中、高濃度（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）的血漿模擬樣品并測定。結(jié)果基質(zhì)效應(yīng)分別為104%、103%、101%，RSD（n＝5）均＜1.9%；內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)為104%，RSD（n＝9）均＜0.6%。

圖1 MRM圖譜Fig 1 MRM chromatograms

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取對(duì)照品工作液適量，加入空白血漿，分別稀釋成200.0、40.0、10.0、3.0、1.0、0.5 ng·mL－1的系列濃度線性工作樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣測定，記錄色譜。以瑞格列奈與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（R）為縱坐標(biāo)，瑞格列奈濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為R＝0.00925c+4.28×10－5（r＝0.9992）。結(jié)果表明，瑞格列奈血藥濃度在0.5～200.0 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為0.5 ng·mL－1，準(zhǔn)確度偏差為－4.9%，RSD（n＝6）為2.4%。

2.6 精密度及回收率試驗(yàn)

按“2.5”項(xiàng)下方法制備低、中、高（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）濃度的血漿樣品，各6份，共4批，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算得日內(nèi)、日間RSD（n＝6）及方法回收率，結(jié)果見表1。同上制備低、中、高濃度（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）的血漿樣品，各6份，分別測定其中瑞格列奈的峰面積S1與相應(yīng)濃度瑞格列奈溶液的峰面積S2，按S1/S2×100%計(jì)算瑞格列奈的提取回收率，結(jié)果分別為83.2%、85.4%、86.6%（n＝6），內(nèi)標(biāo)的提取回收率為91.6%（n＝9）。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝6）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察濃度為1.0、160.0 ng·mL－1的瑞格列奈血漿樣品分別避光室溫放置4 h、樣品處理后室溫放置24 h、凍融3次和凍存32 d的穩(wěn)定性，結(jié)果瑞格列奈峰面積的RSD（n＝6）均＜6.5%，表明血漿樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2.8 血藥濃度測定和藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

2.8.1 研究對(duì)象。24名男性健康志愿者，年齡（20.4±1.2）歲，體重（65.1±5.9）kg，身高（172±5）cm，試驗(yàn)前經(jīng)體檢證實(shí)心、肝、腎功能和血糖等均正常，試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未用其他藥物，且無煙、酒嗜好。本試驗(yàn)方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，志愿者均書面簽署知情同意書。

2.8.2 試驗(yàn)方案。采用完全三交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)（3×3）進(jìn)行本項(xiàng)生物等效性研究，24名受試者隨機(jī)分為6組，每組4人，分別按A1RA2、A1A2R、A2A1R、A2RA1、RA1A2、RA2A1順序入組進(jìn)行試驗(yàn)，每2周期間隔為7 d，共進(jìn)行3周期。根據(jù)瑞格列奈制劑的臨床常用劑量，確定本試驗(yàn)的給藥劑量為4 mg。受試者于試驗(yàn)當(dāng)日晨空腹口服受試制劑和參比制劑，用200 mL溫開水送服，2 h內(nèi)禁水，4 h后各進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐1次。試驗(yàn)期間保持日常輕微活動(dòng)，不允許長時(shí)間臥床，并避免劇烈活動(dòng)。受試者禁用其他藥及含咖啡因類成分的飲料，禁止吸煙、飲酒。

2.8.3 血樣采集。分別在服藥前取空白血樣，于服藥后0.1、0.2、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6 h各個(gè)時(shí)刻采集14個(gè)血樣：自上肢靜脈取血3 mL，注入肝素化管中，混勻后離心（轉(zhuǎn)速：3000 r·min－1）10 min，血漿樣品于－70 ℃冰箱保存待測。

2.8.4 數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)所得瑞格列奈血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS 2.0程序軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，權(quán)重系數(shù)取1。數(shù)據(jù)處理方法用逐個(gè)受試者的藥-時(shí)數(shù)據(jù)作曲線擬合，求得個(gè)體參數(shù)后計(jì)算平均值。tmax、cmax取實(shí)測值，藥-時(shí)曲線下面積（AUC）由梯形法求得，消除半衰期按t1/2＝－0.693/Zeta計(jì)算。cmax及AUC值經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后作方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間檢驗(yàn)，tmax用非參數(shù)法分析，評(píng)價(jià)受試制劑與參比制劑的生物等效性。24名受試者口服單劑量受試制劑A1、A2和參比制劑R的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果見表2；平均藥-時(shí)曲線見圖2。

表2 24名受試者口服受試制劑與參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝24）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of test preparations and reference preparation in 24 healthy volunteers with oral administration（n＝24）

3 討論

本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件建立了LC-MS法測定血漿中瑞格列奈的濃度，經(jīng)過方法學(xué)確證，結(jié)果表明本法專一性好、靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度和線性關(guān)系良好，完全滿足藥動(dòng)學(xué)和生物樣品分析測定要求。本法血樣預(yù)處理較文獻(xiàn)[2～4]簡便易行，甲醇直接沉淀蛋白后直接測定，無需堿化后以乙酸乙酯等有機(jī)試劑提取，并且靈敏度高、分析時(shí)間短，便于進(jìn)行大樣本量的分析測定。

本文國產(chǎn)和進(jìn)口的瑞格列奈片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著差異，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]相似。生物等效性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，國產(chǎn)受試制劑A1、A2的AUC0～6h分別為93.1%～112.9%、88.0%～106.8%，cmax的90%置信區(qū)間分別91.5%～112.0%、89.1%～109.1%。按照生物等效性判斷標(biāo)準(zhǔn)，受試制劑AUC的90%置信區(qū)間落在標(biāo)準(zhǔn)參比制劑的80%～125%之間，cmax落在70%～143%之間即可認(rèn)為等效，故判定受試制劑A1、A2與參比制劑具有生物等效性。受試制劑A1和A2相對(duì)于參比制劑的相對(duì)生物利用度分別為（106.5±31.1）%、（100.9±30.6）%。

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