李鑫，郭雷靜，陸思靜（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

多重/泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDR-Ab/PDR-Ab）的出現(xiàn)，給醫(yī)院感染控制及臨床治療帶來了極大的困難，被稱為21世紀(jì)革蘭陰性菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”。其6個(gè)主要流行克隆株在我國廣泛流行，分布于北京、上海、重慶、沈陽及浙江省的多個(gè)城市[1]。整合子被認(rèn)為是耐藥基因在水平傳播的重要因子。本研究目的在于了解我院MDR-Ab/PDR-Ab的分子流行病學(xué)及整合子是否介導(dǎo)了耐藥基因的傳播。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

我院微生物科2010年各類臨床標(biāo)本中培養(yǎng)并通過MicroScan WalkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)及其配套的鑒定藥敏復(fù)合板鑒定為MDR-Ab/PDR-Ab的38株作為本研究重點(diǎn)，同一患者同一部位只統(tǒng)計(jì)初次分離株。

1.2 儀器與試劑

MicroScan WalkAway-40全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)及其配套的鑒定藥敏復(fù)合板由美國Dade公司生產(chǎn)；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、DNA Marker、dNTPs、內(nèi)切酶HinfⅠ和AVaⅡ、瓊脂糖及凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司（大連TaKa-Ra公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Thermal Cycler 2400為美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品。

1.3 腸桿菌科基因間重復(fù)一致序列（ERIC-PCR）DNA檢測模板的制備

從LB培養(yǎng)基上挑取單個(gè)受試菌落加入5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min－1震蕩孵育16～20 h，取上述培養(yǎng)菌液2 mL，采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA作為模板。

1.4 ERIC-PCR

引物序列：ERIC1：5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；ERIC2：5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。采用25 μL反應(yīng)體系：模板2 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ERIC引物各0.5 μL（25 μmol）、加無菌蒸餾水至總體積25 μL。置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀中反應(yīng)，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s，48℃退火1 min，72℃延伸4 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物在1×TBE電泳緩沖液中電泳，溴化乙錠染色，用紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，收集圖像。

1.5 整合酶基因檢測模板制備

使用煮沸法獲取DNA模板：直接挑取3～4個(gè)菌落于200 μL無菌水中，旋渦振蕩30 s，充分混勻后置沸水浴中恒溫保持10 min后取出，迅速置冰浴中放置10 min；12000 r·min－1離心5 min，取上清2 μL即為DNA模板。

1.6 整合酶基因的檢測

引物序列：IntIF 5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKA ATT-3′；IntIB 5′-CAR CAC ATG GGT RTA RAT-3′，預(yù)擴(kuò)增片段長度為491 bp。采用25 μL PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物（20 μmol·L－1）各0.5 μL，0.125 μLTaq DNA聚合酶5 U·μL－1（TaKaRa公司），加滅菌蒸餾水至總體積25 μL，操作在冰浴中完成。置PCR儀中反應(yīng)，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后按94℃變性1 min，51℃退火30 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保護(hù)。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)明顯亮帶的為初篩陽性，收集圖像。陽性條帶行切膠純化后分別用內(nèi)切酶（HinfⅠ、AVaⅡ）行限制性片段長度多態(tài)性分析，同時(shí)選取酶切片段長度一致的PCR純化產(chǎn)物測序，用BLAST程序分析。

2 結(jié)果

2.1 MDR-Ab/PDR-Ab科室及標(biāo)本分布

38株MDR-Ab/PDR-Ab在ICU檢出率最高，21株，占55.3%；其次為呼吸科7株、神經(jīng)外科4株、骨創(chuàng)傷科2株、燒傷科2株、內(nèi)分泌科1株、血液科1株，分別占18.4%、10.5%、5.3%、5.3%、2.6%、2.6%。標(biāo)本以下呼吸道和手術(shù)切口分離最高，分別占68.4%（26/38）%和15.8%（6/38）。

2.2 ERIC-PCR結(jié)果

ERIC-PCR產(chǎn)物多呈3～5條帶，主帶為2～3條，從250～1500 bp不等。38株MDR-Ab/PDR-Ab由7種基因型組成，其中 1～23為A型，占60.5%（23/38），分別來自ICU 13株，占56.5%（13/23）；呼吸科4株，占17.4%（4/23）；骨科2株，占8.7%（2/23）；血液科1株，內(nèi)分泌科1株，神經(jīng)內(nèi)科1株，神經(jīng)外科1株。37為A型的一個(gè)亞型，來自ICU。24～26為B型，24來自神經(jīng)外科，25、26來自ICU。27為B型的一個(gè)亞型B1型，來自于ICU科。29、33、38為C型，29、33來自呼吸科，38來自ICU。28、36為D型，分別來自神經(jīng)外科和呼吸科。30～32為E型，分別來自呼吸科、高級服務(wù)中心、ICU。34、35分別為F、G型，都來自于ICU。D、F、G型菌株的基因型無密切相關(guān)性。代表菌株ERIC-PCR結(jié)果如圖1。

圖1 ERIC-PCR結(jié)果圖Fig 1 ERIC-PCR results figure

2.3 整合酶基因檢測結(jié)果

38株MDR-Ab/PDR-Ab共檢出含整合酶基因菌株28株，經(jīng)內(nèi)切酶HinfⅠ、AVaⅡ酶切后證實(shí)為Ⅰ類整合子，經(jīng)基因測序比對分析進(jìn)一步證實(shí)為Ⅰ類整合子，檢出率為73.7%（28/38）。A型菌株整合酶基因陽性者17株，占整合酶基因陽性菌株的60.7%（17/28）。來自ICU菌株整合酶陽性菌株為17株，占ICU檢出菌株總數(shù)的的81.0%（17/21），代表結(jié)果如圖2。

圖2 整合酶基因檢測及酶切圖Fig 2 Gene detection of integrase and cleavage map

3 討論

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染呈增高趨勢，特別是多重耐藥（指對3種以上結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制不同的抗菌藥物耐藥）和泛耐藥（指對除粘菌素外的所有臨床上可獲得抗生素均耐藥）引起的感染，在臨床上幾乎無藥可選擇[2]，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我們所研究的這些菌株僅呼吸道標(biāo)本就占67.5%。因此，在對感染性疾病的管理中應(yīng)加強(qiáng)對呼吸道感染的控制和預(yù)防，防止交叉感染及暴發(fā)流行。標(biāo)本分布主要以ICU為主，分離率為55.3%。研究也發(fā)現(xiàn)[3]，患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、免疫功能低下、住院時(shí)間較長、接受侵入性操作、長期應(yīng)用抗菌藥物、應(yīng)用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素等因素均是危重患者發(fā)生多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染的易感因素。

近年來，基因盒-整合子學(xué)說的提出為多藥耐藥性的研究開拓了新領(lǐng)域。整合子是一種新的可移動(dòng)基因元件，其兩端是高度保守序列，分別稱作5′保守端、3′保守端；5′和3′端之間為可變區(qū)，是基因水平傳遞系統(tǒng)。根據(jù)整合子5′保守區(qū)整合酶基因的同源性差異，整合子被分為4類：Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類，其中前3類常與耐藥相關(guān)，又被統(tǒng)稱為耐藥整合子（RI），這些整合子可捕獲和整合細(xì)菌的外源性耐藥基因，造成多種耐藥基因在不同菌株甚至不同菌種間的水平轉(zhuǎn)移，因而與宿主菌的多藥耐藥性的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。經(jīng)過對38株MDR-Ab/PDR-Ab菌株進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，38株菌株分別來自7組不同分型的克隆株，整合酶基因的檢出率為60.7%（17/28）。A型克隆株是ICU的主要類型，A型克隆菌株中整合酶陽性菌株分布在ICU 11株、呼吸科3株、神經(jīng)外科1株和骨科2株。檢出的2株骨科菌株的患者曾在ICU住院治療，說明科室間存在交叉感染的可能性，這種克隆傳播也可能是導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加的重要原因之一。來自ICU的菌株Ⅰ類整合酶基因陽性菌株占81.0%（17/21），低于我國臺(tái)灣地區(qū)的85.0%檢出率[4]，從時(shí)間分布上看，這些菌株在全年均有分布。綜上，整合子在同一克隆株甚至在同一科室之內(nèi)及不同科室之間傳播起到非常關(guān)鍵的作用，因此加強(qiáng)多藥耐藥菌的管理是非常必要的。

依據(jù)我們ERIC-PCR及整合酶基因檢測結(jié)果，結(jié)合國內(nèi)、外研究[5～7]，我們不難發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)的醫(yī)院內(nèi)，多個(gè)相同克隆株在不同科室及個(gè)體間的相互傳播可能是醫(yī)院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌感染原因之一。因此，重視醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生、加強(qiáng)消毒隔離措施、合理應(yīng)用抗生素是控制醫(yī)院MDR-Ab／PDR-Ab感染的重要手段。

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