周曉東，于立軍（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院湯山分院藥械科，南京211131）

難溶性藥物經(jīng)胃腸道給藥面臨的難題在于如何提高其生物利用度，通過改善難溶性藥物從制劑中溶出的速度和藥物的溶解度，進而提高生物利用度，已成為藥學工作者研究和關(guān)注的焦點[1，2]。生物黏附給藥系統(tǒng)（Bioadhesive drug deliverysysterms，BDDS）是利用載藥材料對生物黏膜表面的黏附性能，使給藥系統(tǒng)在生物膜的特定部位滯留時間延長，或達到藥物在特定部位吸收的目的[3，4]。微球（Microsphere）是指藥物溶解或分散在載藥材料基質(zhì)中形成粒徑為1～40 μm的微小球狀實體，是近年來制劑研究的新熱點[5，6]。本文以難溶性藥物硝苯地平（Nifedipine，NFP）為模型藥物，利用BDDS技術(shù)制備NFP生物黏附微球，考察其體外黏附性能和釋藥行為，并對其釋藥機制進行研究，探討制備難溶性藥物生物黏附微球的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALC-210.4分析天平（德國Sartorius公司）；752紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；ZRS-8 G型智能藥物溶出儀（天津天大天發(fā)儀器有限公司）；恒溫水浴箱（常州國華電器有限公司）。

1.2 材料

乙基纖維素水分散體（商品名：Surelease?，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司）；卡波姆934（簡稱CP，北京佳福晨康藥用輔料有限公司）；NFP原料藥（武漢遠城國際集團，批號：20100901，純度：99.6%）；NFP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100338，純度：99.5%）；聚乙烯醇（PVA，上海強順化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

透析袋（天長市康鴻塑業(yè)有限公司，截留分子量：1000）。

2 方法與結(jié)果

2.1 NFP生物黏附微球的制備

取處方量的NFP溶于適量丙酮溶液中，混合均勻，磁力攪拌下將上述溶液加入分散介質(zhì)司盤80中分散，攪拌1～2h。依次加入適量戊二醛（交聯(lián)劑）和硫酸（固化劑），使之交聯(lián)成球。減壓抽去溶劑，依次用丙酮和水各洗滌3遍，取微球置于干燥器中干燥過夜。收集制得的微球，用Surelease?和CP混合液包黏附衣層，包衣溫度60℃，包衣干燥時間4 h，包衣增重15%，干燥后貯存，即可得到NFP生物黏附微球；同法制備不含包衣層的微球。

2.2 NFP含量測定方法學考察

精密稱取干燥至恒重的NFP 30 mg，用少許甲醇溶解后再以乙醇定容至100 mL，作為貯備液。精密吸取貯備液1、2、3、4、5、6mL置于50mL棕色量瓶中，以0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液定容至刻度，制備成硝苯地平濃度分別為6、12、18、24、30、36 μg·mL－1的系列標準溶液；以0.5%SDS水溶液為空白，在333 nm波長下測定吸光度。以濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，進行線性回歸處理，得回歸方程為y＝0.0115 x+0.0015（r＝0.9993），結(jié)果，NFP檢測濃度線性范圍為6～36 μg·mL－1。分別進行低、中、高濃度（10、20、30 μg·mL－1）的回收率試驗和精密度試驗，結(jié)果低、中、高濃度的平均回收率為99.5%（RSD＝1.8%），日內(nèi)RSD分別為2.3%、1.5%、2.2%，日間RSD分別為2.4%、1.8%、2.0%，表明方法的準確度和精密度均符合要求。

2.3 正交試驗設(shè)計優(yōu)化生物黏附微球處方工藝

在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，設(shè)計制備微球，總處方量為5mL，分別對影響微球質(zhì)量的因素進行考察：加熱溫度（A，℃）、PVA用量（B，g）、司盤濃度（C，%）、戊二醛用量（D，mL）。每個因素選取3個水平，選用L9（34）正交設(shè)計表，以藥物24 h累積釋藥率為評價指標，優(yōu)化微球處方。L9（34）正交試驗設(shè)計因素和水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素和水平Tab 1 Factor and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal design

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Result of variance analysis

由直觀分析可知，各因素對藥物釋放的影響大小順序為因素C＞D＞B＞A。通過方差分析可知，D因素的變化有統(tǒng)計學差異，故優(yōu)選D2，而A、B、C因素的變化無統(tǒng)計學差異，綜合考慮，確定處方優(yōu)選結(jié)果為D2A2B2C2，即加熱溫度為60℃，PVA用量為0.6 g，司盤濃度為5%，戊二醛用量為0.6 mL。以此制備3批樣品，進行質(zhì)量考察。

2.4 微球的質(zhì)量考察

2.4.1 載藥量、包封率的測定。取微球加入研缽中研磨，精密稱量50 mg，置于25 mL量瓶中，加入適量0.5%SDS溶液后，超聲溶解，定容，搖勻，靜置。濾過，取續(xù)濾液備用。精密量取續(xù)濾液1 mL置于100 mL量瓶中，加入0.5%SDS溶液稀釋至刻度，搖勻。取以相同方法制備的空白微球溶液和對照品溶液，于333 nm波長處測定吸光度。每批微球測定3次，由外標法計算藥物濃度，根據(jù)下列公式計算微球包封率和載藥量[7]：包封率（%）＝（微球中的含藥量/微球與介質(zhì)中的總藥量）×100%，載藥量（%）＝（微球中NFP質(zhì)量/微球總質(zhì)量）×100%。結(jié)果平均載藥量約為15%，包封率約為85%，詳見表4。

表4 3批微球載藥量及包封率測定結(jié)果Tab 4 Results of drug-loading amount and encapsulation efficiency of 3batches of microspheres

2.4.2 微球粒徑的測定。取微球適量，分散于適量水中，超聲震蕩15 min后，均勻涂布于載玻片上，采用光學顯微觀察微球的粒徑及分布。根據(jù)公式D＝∑（nd）/∑n（D：平均粒徑；n：微球個數(shù)；d：統(tǒng)計范圍內(nèi)微球等價粒徑的平均值）計算800個微球的粒徑得平均粒徑，再根據(jù)800個微球粒徑的統(tǒng)計結(jié)果，分析微球粒徑的分布范圍[7]，結(jié)果見圖1。

圖1 微球粒徑分布圖Fig 1 The particle size distribution of microspheres

從圖1可見，本法制備的微球平均粒徑約為20μm，其粒徑85%均勻分布在16～20μm左右，可知粒徑分布均勻。

2.4.3 體外黏附性能的評價。采用自制的體外黏附力測定裝置[8]。試驗時用502膠水將適量生物黏附微球的一側(cè)固定于2 cm×2 cm背面帶掛鉤的聚氯乙烯薄片B上，備用；將已準備的大鼠胃組織剪成小片，用502膠水固定于相同規(guī)格的薄片A上。滴加生理鹽水5滴于微球表面潤濕10 min后與固定于薄片A的胃組織接觸，并給予500 g壓力，施壓時間5 min，將薄片A掛鉤垂直固定，在薄片B掛鉤上掛系一塑料袋，以8～10 mL·min－1的速度向袋中注水，直至微球下側(cè)與黏膜分離，記錄塑料袋、水及薄片B的重量（g），即得體外最大黏附力。測定3批微球的最大體外黏附力并與未包衣的微球比較，結(jié)果見表5。

表5 2種微球體外黏附力測定結(jié)果Tab 5 The adhesive ability of 2kinds of microspheres in vitro

由表5可知，黏附微球體外黏附力明顯高于未包衣微球，前者具有較好的黏附效果。

2.4.4 體外釋放性考察。以900 mL 0.5%SDS溶液為釋放介質(zhì)，保持溫度在（37±1）℃。精密稱取適量微球，置于透析袋中，將透析袋放入釋放杯中，開啟攪拌（100 r·min－1）。分別于0、1、2、4、8、12、14、18、24 h取樣5 mL（同時在溶出杯中補入相同體積的新鮮釋放介質(zhì)）。濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于25 mL量瓶中，加入0.5%SDS溶液至刻度，搖勻。取相同方法制備的空白微球溶液和對照品溶液，于333 nm波長處測定吸光度。按外標法計算各點的藥物濃度，求算3批微球的累積釋藥率，繪制體外釋藥曲線，見圖2。

圖2 微球的體外釋藥曲線（n＝3）Fig 2 Drug release curves of microspheres in vitro（n＝3）

由圖2可見，微球可持續(xù)24 h釋藥；體外釋藥曲線分別按零級、一級、Higuchi方程擬合，結(jié)果顯示所制微球數(shù)據(jù)符合Higuchi釋藥動力學方程（r＞0.9900），具有較好的體外緩釋性能。

2.5 釋藥機制研究

根據(jù)藥物從骨架中釋放機制的Ritger-Peppas方程[9]可知：Mt/M∞＝ktn。式中：Mt/M∞為藥物在某一時間的累積釋藥率；t為釋放時間；k為常數(shù)，該常數(shù)隨不同藥物或不同處方以及不同釋放條件而變化，表示釋放速率大小的重要參數(shù)；n為釋放參數(shù)，為Ritger-Peppas方程中表示釋放機制的特征參數(shù)（當n＜0.45時，服從Fick擴散；當n＞0.89時，為骨架溶蝕機制；當0.45＜n＜0.89時，為非Fick擴散機制，藥物釋放機制為混合型，即藥物釋放為藥物的擴散和骨架溶蝕雙重機制[9]）。

結(jié)果，Ritger-Peppas擬合方程為：lnQ＝0.7512 t+2.0821（r＝0.9978），其中n＝0.7512（0.45＜n＜0.85），為非Fick擴散機制，表明NFP從自制黏附微球中以擴散和骨架溶蝕2種途徑釋放。

3 討論

本試驗中采用乙基纖維素水分散體Surelease?和CP混合作為外層黏附衣層，一方面可以通過Surelease?適當?shù)哪た子行д{(diào)節(jié)NFP的釋放行為，另一方面可以借助CP的黏附性能使微球較長時間地黏附于胃腸黏膜[10]，增加藥物吸收，以期提高難溶性藥物的生物利用度。

生物黏附微球的制備過程中可變因素較多，本文在單因素考察的基礎(chǔ)上通過正交設(shè)計優(yōu)化處方工藝，分別考察了加熱溫度等各因素對微球釋藥的影響，最終以優(yōu)選處方工藝連續(xù)制備3批樣品并評價其質(zhì)量。結(jié)果顯示所制微球具有緩釋性，其釋藥機制符合非Fick擴散機制，藥物以溶蝕和擴散2種模式釋放。

本研究建立的體外黏附力的測定可在一定程度上反映制劑體內(nèi)的黏附性能，但準確度仍需進一步探明。同時，NFP生物黏附微球體內(nèi)釋藥行為及體內(nèi)吸收的相關(guān)性等仍有待于進一步研究。

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