高 峰，何玉秀，郝 強，牛凌坤，金鳳霞

“編程作用假說（Programming Hypothesis）”認為，在生長發(fā)育的關(guān)鍵期如胚胎期，發(fā)育環(huán)境的波動會對子代在基因、細胞和組織的功能和結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生編程性的影響［16］。López M.研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期減少母鼠喂養(yǎng)仔鼠數(shù)目可對子代過度喂養(yǎng)肥胖大鼠（the overfed rat，OF大鼠）下丘腦攝食調(diào)控中樞產(chǎn)生可塑性的作用，OF大鼠斷乳后持續(xù)保持超重／肥胖表型［15］。OF大鼠是研究哺乳期過度營養(yǎng)誘發(fā)子代體重編程作用的經(jīng)典模型，研究顯示，OF大鼠下丘腦攝食和能量調(diào)控異常、胰島素抵抗和瘦素抵抗是OF大鼠持久 表 現(xiàn) 為 超 重 和 肥 胖 的 關(guān) 鍵［9，10，18］。

毋庸置疑，孕期運動有改善子代腦功能、增加學(xué)習(xí)記憶能力，提高中樞神經(jīng)興奮性、增加能量消耗、改善insulin敏感性等對維持和改善機體健康水平的諸多益處［1，14］?！爸袠袛z食和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)”是孕期母體和子代的營養(yǎng)分配、子鼠哺乳期營養(yǎng)和子鼠體重表型相互作用和相互聯(lián)系的重要樞紐。而嚙齒類在出生后3周下丘腦攝食調(diào)控中樞才發(fā)育完全，從孕中期到哺乳期結(jié)束其下丘腦攝食中樞具有很強的可塑性［7］。那么，孕期游泳運動是否會通過改善母親胎盤機能，進而對子代下丘腦攝食調(diào)控中樞發(fā)育產(chǎn)生怎樣的影響？據(jù)此，本研究從神經(jīng)內(nèi)分泌的角度，探究了孕期低強度游泳運動對斷乳后OF大鼠下丘腦弓狀核食欲相關(guān)肽基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

飼養(yǎng)條件：SD純系大鼠，雌性大鼠80只（275±5g），雄鼠20只（350±5g），購自河北省動物實驗中心；室溫23℃±2℃，濕度50%±5%，控制光周期，標準飼料飼養(yǎng)。

母鼠 孕 期 運 動 方 案：10min／d，6d／week［14］。 游 泳 設(shè)備為150cm×50cm×90cm游泳池，水溫34℃±2℃；母鼠分娩后次日，選取每窩產(chǎn)仔數(shù)目10～13只的母鼠及其仔鼠，其余剔除。

OF大鼠模型復(fù)制：生殖突與肛門間距離甄別性別，調(diào)整每窩喂養(yǎng)仔鼠數(shù)目，過度喂養(yǎng)為每窩4只雌鼠和正常喂養(yǎng)為每窩10只雌鼠，直至哺乳期21天后斷乳［11，12］。模型判定標準為：體重、Lee指數(shù)和胰島素水平顯著高于正常喂養(yǎng)組［9］。

子代大鼠實驗分組：斷乳后按體重配比隨機抽取獲得實驗分組。孕期安靜＋哺乳期正常喂養(yǎng)模型對照組（CNC1，n＝8）、孕期安靜＋哺乳期過度喂養(yǎng)斷乳后OF對照組（CSC1，n＝8）和孕期低強度游泳運動＋哺乳期過度喂養(yǎng)斷乳后 OF組（ESC1，n＝8）。

1.1.2 標本采集

子代大鼠取材流程：1）斷乳后次日稱重，內(nèi)眥取血分離血清后－30℃保存；2）灌流液固定取全腦，選取自視交叉至乳頭體區(qū)域后固定4～6h后，移入70%酒精過夜，次日進入石蠟包埋程序。所有溶液配置均用0.1%DEPC處理，以滅活外源性核酸酶。

1.1.3 主要試劑和設(shè)備

NPY、POMC和LRb原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德。血糖和血脂采用酶化學(xué)法在全自動分析儀上測定，試劑盒分別購于北京利德曼生化技術(shù)有限公司和河北長城臨床試劑有限公司；血清胰島素（insulin）和瘦素（leptin）采用放射免疫法測定，試劑盒購于中國原子能科學(xué)研究所。胰島素敏感性評價指標為胰島素與血糖比（the ratio of insulin to glucose，IGR）＝FIN值／血糖值［13］。

1.2 材料

1.2.1 原位雜交檢測和分析

所有溶液用DEPC水配制，原位雜交程序參照試劑盒（武漢博士德）說明進行。1）腦冠狀切片：從弓狀核的吻部至尾部分段切片（每20張取1張），切片厚度5μm，撈片于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片，60℃拷片6h。2）脫蠟至水后，暴露mRNA核酸片段：滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37℃消化10min；0.5MPBS洗3次×5min，蒸餾水洗1次。3）預(yù)雜交：濕盒內(nèi)每張切片加預(yù)雜交液20μl，恒溫箱40℃12h，棄多余液體，不洗。4）雜交：滴加雜交液，恒溫箱42℃雜交過夜。陰性對照組在雜交時以不含探針的雜交液進行雜交，其余步驟相同；雜交后洗滌，滴加封閉液，37℃30min，甩去多余液體，不洗。5）雜交后洗滌，滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃30min，原位雜交專用PBS洗5min×4次。6）滴加SABC：37℃30min，甩去多余液體，不洗；滴加生物素化過氧化物酶，37℃30min，0.5MPBS洗3次×5min。7）DAB顯色和封片：DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染細胞核1min，1%鹽酸酒精分色，1%氨水反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

陽性表達判斷標準：切片背景為淺藍色或無色，以神經(jīng)元的胞體呈現(xiàn)淺黃、棕黃、棕褐色均為陽性表達。每只大鼠取3張切片，每張切片取高倍鏡（10×40）下4個視野，通過Olympus DP70數(shù)碼相機拍攝后以JEP文件形式將圖片輸入計算機。采用IPP 6.0（Image－Pro Plus v6.0）圖像采集分析系統(tǒng)，對所采集圖像進行積分光密度分析。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 孕期低強度游泳運動對OF大鼠體重和血清指標的影響

圖1和圖2顯示，CSC1組和ESC1組OF大鼠體重、Lee指數(shù)、血糖、胰島素、IGR、瘦素和總膽固醇（TC）水平均顯著高于CNC1組大鼠。ESC1組與CSC1組OF大鼠相比，兩組OF大鼠血清代謝指標均無顯著性差異（圖2）。

2.2 孕期低強度游泳運動對OF大鼠ARH內(nèi)LRbmRNA表達的影響

LRb mRNA原位雜交結(jié)果（圖3）顯示，ESC1組和CSC1組OF大鼠下丘腦ARH內(nèi)LRb mRNA水平相比無顯著性差異（0.43±0.023vs 0.41±0.006，P＞0.05），而CNC1大鼠下丘腦ARH內(nèi)LRb mRNA水平顯著高于ESC1組和CSC1組OF大鼠（0.53±0.009vs 0.43±0.023，P＜0.01和0.53±0.009vs.0.41±0.006，P＜0.01）。

圖1 本研究OF大鼠體重和Lee指數(shù)的組間比較示意圖（n＝8，SD）Figure 1. Comparison of Body Weight and Lee Index of Three Groups

圖2 本研究OF大鼠血清學(xué)指標的組間比較示意圖（n＝8，SD）Figure 2. Comparison of Serum Parameters of Three Groups

圖3 本研究OF大鼠下丘腦弓狀核LRbmRNA水平組間比較示意圖Figure 3. Comparison of mRNA Expression of LRb in ARH among Groups

2.3 孕期低強度游泳運動對OF大鼠ARH內(nèi)NPY和POMC的mRNA水平的影響

孕期游泳運動對斷乳后ESC1組和CSC1組OF大鼠下丘腦弓狀核NPY mRNA表達無顯著性影響（P＞0.05）；孕期安靜正常喂養(yǎng)CNC1組下丘腦弓狀核NPY mRNA表達顯著低于ESC1組和CSC1組OF大鼠（P＜0.01和P＜0.01；圖4）。孕期游泳運動對斷乳后ESC1組OF大鼠下丘腦弓狀核POMC mRNA表達顯著高于孕期安靜CSC1對照組OF大鼠（P＜0.01）；孕期安靜正常喂養(yǎng)對照組（CNC1組）在下丘腦弓狀核POMC mRNA表達顯著低于ESC1組和CSC1組 OF大鼠（P＜0.01和P＜0.01；圖5）。

3 討論與分析

3.1 孕期低強度游泳運動對斷乳后OF大鼠血瘦素和ARH內(nèi)LRb mRNA表達的影響

新生早期是機體生長發(fā)育最快的階段，機體正處于能量獲得和利用最優(yōu)化階段。在大鼠和小鼠研究中顯示，新生早期均出現(xiàn)血瘦素激增現(xiàn)象，且這一現(xiàn)象是獨立于體重的；盡管新生大鼠或小鼠的血瘦素水平呈現(xiàn)激增，但還保持較高的攝食水平［8］?？梢?，哺乳動物新生早期表現(xiàn)出的“一過性瘦素抵抗現(xiàn)象”是對新生早期機體快速發(fā)育的適應(yīng)性反應(yīng)。本研究中，哺乳期過度喂養(yǎng)可誘發(fā)大鼠體重超重／肥胖、血瘦素和血胰島素水平升高，而母鼠孕期游泳運動對子代OF大鼠肥胖、血胰島素和血瘦素敏感性降低沒有顯著改善效果。相關(guān)研究還顯示，哺乳期小窩過度喂養(yǎng)可導(dǎo)致OF大鼠在斷乳后21天表現(xiàn)出顯著肥胖、高瘦素血癥、高胰島素血癥和空腹IGR升高并可持續(xù)到成年期［10，17，18］?？梢?，新生早期營養(yǎng)過剩極易誘發(fā)“一過性瘦素抵抗現(xiàn)象”發(fā)展為“永久性瘦素抵抗”，而孕期低強度游泳運動對斷乳后OF大鼠體重編程作用無顯著預(yù)防效果。

圖4 本研究OF大鼠下丘腦弓狀核NPY mRNA水平組間比較示意圖Figure 4. Comparison of mRNA Expression of NPY in ARH among Groups

圖5 本研究OF大鼠下丘腦弓狀核POMC mRNA水平組間比較示意圖Figure 5. Comparison of mRNA Expression of POMC in ARH among Groups

瘦素如腦主要通過飽和轉(zhuǎn)運機制跨越血腦屏障進入腦脊液［4，19］。瘦素受體主要有5種亞型，研究顯示，瘦素長型受體（LRb）是參與ARH內(nèi)瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要形式［6］。瘦素抵抗是兒童肥胖癥代謝異常主要表現(xiàn)［3］，但其具體機制尚未完全闡明［20］。本部分實驗顯示，OF大鼠ARH內(nèi)LRb mRNA水平顯著低于正常喂養(yǎng)對照組大鼠，表明哺乳期過度營養(yǎng)誘發(fā)的ARH內(nèi)瘦素敏感性下降與LRb受體表達降低有關(guān)。但也不能排除哺乳期營養(yǎng)過度誘發(fā)的瘦素抵抗還可能與血腦屏障飽和轉(zhuǎn)運、受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制異常有關(guān)?？梢?，孕期低強度游泳運動對下丘腦弓狀核LRbm RNA表達下降所至瘦素抵抗無顯著改善效果，是孕期游泳運動對斷乳后OF大鼠體重編程作用無改善效果的潛在中樞機制之一。

3.2 孕期低強度游泳運動對斷乳后OF大鼠ARH內(nèi)NPY和POMC mRNA表達的影響

ARH內(nèi)POMC／CART和NPY／AgRP神經(jīng)元是重要的瘦素中樞內(nèi)作用靶點：當外周血瘦素水平升高，則ARH內(nèi)參與能量調(diào)控的“一級”神經(jīng)元POMC／CART表達增加，而NPY／AgRP的表達水平降低；同時，位于ARH內(nèi)參與能量調(diào)控的“一級”神經(jīng)元的軸突進一步將信號傳遞到下一級神經(jīng)元（下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、室旁核、背側(cè)核和后側(cè)核），最后在皮層整合以維持體重在調(diào)定點范圍內(nèi)［21］。本研究主要針對外周血激素進入中樞的第一靶點——ARH，結(jié)果顯示，ARH內(nèi)陽性NPY神經(jīng)元胞體輪廓較清晰，細胞形態(tài)不一，偶可見胞體有短突起。與以往相關(guān)OF大鼠體重編程作用中樞機制的研究結(jié)果基本一致［15］，過度喂養(yǎng)導(dǎo)致OF大鼠ARH內(nèi)NPY mRNA水平顯著高于正常喂養(yǎng)斷乳后對照組。這一方面說明，發(fā)育期間的過度喂養(yǎng)誘發(fā)ARH內(nèi)NPY mRNA高表達，使OF大鼠食欲亢進，能耗減少，脂肪合成增加，從而導(dǎo)致OF肥胖；另一方面，由于新生早期瘦素通過中樞能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控通路實現(xiàn)抑制攝食和增加能量消耗的能量平衡負調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)尚未發(fā)育完全［7］，ARH內(nèi)LRb mRNA水平下降使瘦素對NPY神經(jīng)元的反饋調(diào)節(jié)受阻，進而又引發(fā)NPY抵抗，NPY抵抗與肥胖程度正相關(guān)，即肥胖程度越大，NPY抵抗越明顯。

本研究還發(fā)現(xiàn)，OF大鼠下丘腦弓狀核內(nèi)NPY和POMC mRNA表達均顯著高于正常喂養(yǎng)對照組。大鼠新生早期神經(jīng)肽發(fā)育的研究顯示，促進食欲和合成代謝的神經(jīng)肽是優(yōu)先表達的，抑制食欲促進分解代謝的神經(jīng)肽滯后表達，這一時序性特點是保證機體早期成長發(fā)育所必需的［2］。說明早期過度營養(yǎng)造成OF大鼠體重編程作用，與大鼠NPY系統(tǒng)和POMC系統(tǒng)發(fā)育的時序性特點有關(guān)；同時，對照組OF大鼠ARH內(nèi)POMC mRNA表達沒有隨NPY mRNA表達升高而降低，也說明下丘腦食欲和能量系統(tǒng)中還存在對早期過度喂養(yǎng)的保護性反應(yīng)。

本實驗進一步探究孕期低強度游泳運動對哺乳期小窩喂養(yǎng)OF大鼠ARH內(nèi)NPY和POMC mRNA的影響，發(fā)現(xiàn)孕期低強度游泳運動可使OF大鼠ARH內(nèi)POMC mRNA水平升高，而對NPY mRNA水平?jīng)]有顯著影響?？梢?，孕期低強度游泳運動對OF大鼠體重編程作用預(yù)防效果雖不顯著，但是，孕期低強度游泳運動有提高OF大鼠ARH內(nèi)POMC mRNA表達水平的作用，說明孕期低強度游泳運動有顯著增加機體對攝食過度保護性反應(yīng)的作用。究其原因，本研究采用孕期低強度游泳運動方式，主要目的是通過有規(guī)律的身體鍛煉增加孕鼠體力活動水平，改善或緩解由于妊娠所致的血糖生理性升高的致胰島素抵抗的內(nèi)環(huán)境。本研究還發(fā)現(xiàn)，該孕期低強度游泳運動方案對新生仔鼠體重沒有顯著影響。綜上可知，低強度游泳運動沒有對宮內(nèi)胚胎發(fā)育產(chǎn)生營養(yǎng)脅迫；從預(yù)見性適應(yīng)反應(yīng)假說分析，孕期母鼠營養(yǎng)均衡并輔助以有規(guī)律的低強度身體鍛煉，會對胎鼠的代謝和能量調(diào)控系統(tǒng)產(chǎn)生與營養(yǎng)供應(yīng)充足相適應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，當后續(xù)營養(yǎng)環(huán)境與預(yù)測一致或錯配差異不十分顯著時，則早期的應(yīng)答是有利于機體保持正常的代謝和能量調(diào)控系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)；孕期低強度游泳運動可能起到增強胎盤機能，優(yōu)化宮內(nèi)胎兒發(fā)育的激素環(huán)境和血液營養(yǎng)供應(yīng)效果，但尚需要進一步研究以提供有力的證據(jù)支持。

4 小結(jié)

圍產(chǎn)期（孕期和哺乳期）是子代中樞攝食和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控發(fā)育的可塑期，哺乳期過度喂養(yǎng)可對OF大鼠ARH內(nèi)食欲相關(guān)肽的表達產(chǎn)生可塑性影響，而孕期低強度游泳運動增加OF大鼠下ARH內(nèi)POMC mRNA水平，顯示孕期低強度游泳運動具有對早期過度喂養(yǎng)誘導(dǎo)肥胖的潛在性保護作用。但是，孕期低強度游泳運動對子代中樞攝食和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控發(fā)育作用的“子宮內(nèi)機制”有待進一步的研究，以為孕期游泳運動促進子代中樞攝食和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)育提供更有力支持。

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