黃華，林慶宇，羅楊合，張志，陳振林

（賀州學院，廣西 賀州 542800）

活性氧自由基是生物體新陳代謝過程中產生的一類具有高度氧化活性的物質，其化學性質相當活躍，易對組織細胞造成損傷，引起機體衰老，誘發(fā)腫瘤等惡性疾病[1]。食用抗氧化性食品對抑制因活性氧自由基引起的心血管等疾病具有一定作用，但是，目前廣泛被應用的食品抗氧化劑大多屬人工合成，其安全可靠性不足[2]。因此研究抗氧化劑的抗氧化能力和抗氧化過程，開發(fā)合成抗氧化劑的替代物質顯得極為重要。從天然植物的不同部位中提取具有抗氧化能力的物質[3-5]，已被認為是尋求安全可靠天然抗氧化劑的一種有效方式。

馬蹄皮作為馬蹄加工過程中所產生的廢料，在對其前期的研究中發(fā)現(xiàn)其含有豐富的黃酮和色素[6-7]，并確定了其抗氧化性能[8-9]。但研究者多將注意力放在單一成分上，關于馬蹄皮總提取物的組成及協(xié)同抗氧化性能的研究鮮見報道。本文利用乙醇、甲醇、水、乙酸乙酯4種試劑，研究了不同溶劑提取物的還原能力及對DPPH和羥自由基的清除能力，研究不同溶劑提取物的抗氧化能力差異的同時，確定了馬蹄皮提取物中多組分可能存在的協(xié)同作用，以利于進一步開發(fā)利用馬蹄皮資源。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮馬蹄皮剔除腐爛部分，用自來水清洗去除雜質，于50℃下烘干至恒重，用粉碎機粉碎，過100目篩子獲得粒徑統(tǒng)一的顆粒，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 不同溶劑提取物的制備

稱取荸薺皮粉4 g，置于錐形瓶中。加入100 mL蒸餾水（1∶25，質量體積比）在35℃下提取24 h，過濾后濾渣再以水提取2次，每次1 h。合并濾液，將濾液于真空下濃縮，得浸膏狀提取物,記為WE。使用相同的方法分別獲得甲醇（80%，體積分數(shù)），乙醇（40%，體積分數(shù)）和乙酸乙酯總提取物，分別記為ME、EE和EAE。

1.3 提取物清除DPPH自由基能力

移取150μmol/L DPPH溶液1 mL于不同比色管中后分別加入馬蹄皮提取物，用蒸餾水補足至5 mL，使反應體系中提取物濃度分別為5、10、20、30、50、70、100、150、200μg/mL，充分混勻，在室溫（25℃）下靜置30 min后，在波長517 nm處測定其吸光值，記為樣品吸光值。同時，以1 mL DPPH溶液與4 mL蒸餾水混合液作為空白，在波長517 nm處測定其吸光值，記為空白吸光值，計算提取物對DPPH自由基的清除率，重復3次，以VC作對照。

1.4 清除羥基自由基能力

參照文獻[10]，在6支試管中分別加入濃度均為1.0 mmol/L Fe2+、水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，分別加入1.0 mL質量濃度為0.1、0.3、1、2、3、4、5 mg/mL 的樣品溶液，加蒸餾水至5.0 mL，再分別加入1.0 m mol/L H2O21.0 mL，在37℃水浴下反應，60 min后以蒸餾水為參比，于510 nm處測吸光度值。每個試樣作3次平行試驗，取其平均值。清除率計算公式為:

式中：A0為空白樣吸光度；A1為試樣吸光度。

1.5 總還原能力

參照文獻[11]的方法，在2.5 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同質量濃度的樣品液2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50℃恒溫20 min后，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/min離心分離10 min，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1%FeCl3溶液1 mL，在700 nm處測定吸光度。吸光度越高。還原能力越強。試驗重復3次。

1.6 薄層層析

稱取硅膠G 3 g，置于研缽中，加0.8%羧甲基纖維素鈉溶液6 mL，調成均勻的糊狀，涂于預先洗凈晾干的玻璃板上，迅速振動玻璃板使吸附劑薄層均勻平整，陰干后于烘箱105℃烘0.5 h活化，備用。

在距薄層板一端約1.5 cm處，取少量的總提取物，用毛細管點樣于活化好的硅膠板上，將點上樣品的薄層板置于裝有體積比為8∶1∶1的乙酸乙酯，甲酸，水做展開劑的層析缸中用上行法展開后，用25%的氨水熏蒸顯色，并于日光和紫外分析儀下觀察，記錄，并計算Rf值。

2 結果與討論

2.1 馬蹄皮不同溶劑提取物清除DPPH能力的測定

DPPH自由基是一種以氮為中心、十分穩(wěn)定的自由基。在與提取物接觸時，其氮原子中的孤電子發(fā)生配對，導致溶液顏色變淺，吸光度發(fā)生變化，從而可以指示提取物對自由基的清除能力。

不同濃度馬蹄皮提取物清除DPPH自由基的能力見圖1。

圖1 馬蹄皮提取物對DPPH的清除能力Fig.1 Antioxidant activities of different E.tuberosa extractions as assessed by DPPH method compared with ascorbic acid

由圖1可以看出，乙醇提取物對DPPH的清除率最高，在最高濃度下（200μg/mL），提取物清除能力的大小分別為：EE（77.84%）＞W(wǎng)E（55.06%）＞ME（42.34%）＞EAE（27.6%）。馬蹄皮提取物具有清除DPPH自由基的能力，隨著荸薺皮提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，說明馬蹄皮提取物對DPPH自由基的清除能力與其濃度存在明顯的劑量效應關系。

馬蹄皮提取物具有清除DPPH自由基的能力可能與其中含有多酚及黃酮類化合物等多種抗氧化活性成分有關。為進一步確定黃酮的種類，將乙醇提取樣液在薄層板上點樣，薄層展開顯色后，顯示樣液有2個斑點，呈淡黃色，Rf分別為0.53和0.82。因此可以初步判斷馬蹄皮乙醇提取物的黃酮成分為2種黃酮類化合物。

2.2 羥自由基清除能力檢測

羥自由基是組織細胞中產生的最有代表性的活性氧自由基，其對細胞膜內的氫原子有氧化作用，提取物對羥自由基的清除能力是評價抗氧化能力的重要指標之一。根據(jù)Fenton反應的方法建立反應體系模型，水楊酸捕捉·OH產生有色產物，該產物在510 nm波長處有強吸收。若在反應體系中加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，而使有色產物生成量減少，在510 nm波長處測量各濃度下的吸光度，便可確定提取物對自由基的清除能力，結果見圖2。結果表明，馬蹄皮乙醇提取物對羥自由基的清除能力最高，在5 mg/mL濃度下，不同提取物的清除順序依次為EE（83.25%）＞EAE（70.45%）＞ME（60.50%）＞W(wǎng)E（58.82%）。同時在0.1～3.0 mg/mL濃度范圍內，隨提取物對羥自由基的清除率隨濃度的增加而增大。

圖2 提取物對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity of ETP extraction by various solvents toward hydroxyl radical

從圖2可以看出，乙醇和乙酸乙酯提取物對羥基自由基的清除能力強，這表明馬蹄皮提取物中的抗氧化成分有較高的極性，含有酚類官能團。另一方面，乙酸乙酯提取物對羥自由基的清除能力（70.45%）大于對DPPH的清除能力（27.6%），說明不同活性成分與自由基的結合方式不同，極性多組分之間可能存在著相互協(xié)同的作用，同樣的現(xiàn)象用電化學方法在藥用植物的研究中也得到了證實[13]。

2.3 總還原能力測定

抗氧化劑可以引起鐵氰化物的還原，通過觀察在添加馬蹄皮不同溶劑提取物后，測定普魯士藍在700 nm處吸光度的變化檢測樣品的還原能力，吸光值越高，表示還原力越強。馬蹄皮不同提取物還原能力的大小見圖3。

圖3 不同提取物總還原能力Fig.3 Reducing power of extracts at different concentrations by spectrophotometric detection of the Fe3+-Fe2+transformation

結果表明：4種提取物均有一定的還原能力，且隨著濃度的增加而提高，其還原能力強弱順序依次為EE>ME>WE>EAE。還原能力的測定結果表明馬蹄皮提取物中含有一定數(shù)量的還原酮，乙醇對還原酮提取效率較高。

3 結論

利用乙醇、甲醇、水、乙酸乙酯4種溶劑獲得馬蹄皮提取物?？寡趸缘膶嶒灲Y果表明4種提取物都具有一定的還原能力，對DPPH和羥自由基的清除作用明顯，其中乙醇溶劑提取物的對自由基的清除效果最為顯著，且該清除效力具有一定的量效關系。薄層層析表明馬蹄皮乙醇提取物中含2種黃酮類化合物，且提取物中的不同抗氧化活性組分間可能存在著一定的相互協(xié)同作用，共同形成對自由基的清除作用。馬蹄皮提取物是一種很好的天然自由基清除劑，這為我們合理開發(fā)利用馬蹄皮資源和研制安全可靠的食品天然添加劑提供了理論依據(jù)，同時后續(xù)研究將對活性成分進行分離定性。

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