孟祥敏，殷金蓮

（大興安嶺職業(yè)學院，黑龍江 加格達奇 165000）

木瓜，屬薔薇科木瓜屬植物，為多年生落葉灌木或小喬木，是集食用、藥用、觀賞于一體的多用途植物。中醫(yī)認為木瓜有“舒筋活絡、健脾開胃、舒肝止痛”的藥理作用[1]?，F(xiàn)代研究表明,木瓜富含多種氨基酸及營養(yǎng)元素，并含有黃酮、SOD、齊墩果酸等多種活性物質(zhì)[2-3]。木瓜的主要藥效成分為齊墩果酸，據(jù)文獻報道，齊墩果酸具有消炎抑菌、降低轉(zhuǎn)氨酶的作用，還可以促進肝細胞再生、防止肝硬化、降血脂、降血糖、增強機體免疫功能、抑制變態(tài)反應等，是當前治療肝炎的有效藥物之一[4-6]。

近年來，人們對木瓜果實中齊墩果酸進行研究，但超聲波法提取齊墩果酸的報導較少。為此，本文利用超聲波法提取木瓜果實中的齊墩果酸，并利用響應面法對提取參數(shù)進行優(yōu)化，對指導生產(chǎn)具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

木瓜干：陜西省白河縣提供；齊墩果酸對照品（98%）：陜西慧科植物開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

DFT-50型小型萬能破碎機、101-0型電熱恒溫鼓風干燥箱、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海比朗儀器有限公司；KQ-600DB型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀：日本島津公司；JA2003A型精密電子天平：上海達平儀器有限公司；HH-S1型恒溫水浴鍋：金壇市瑞華儀器有限公司等。

1.2.2 試劑

無水乙醇（分析純）、冰醋酸（分析純）、三乙胺（分析純）、甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）等。

2 方法

2.1 木瓜中齊墩果酸的提取方法

將木瓜干粉碎，過30目篩。稱取木瓜粉1 g，加入50 mL無水乙醇，在不同條件下超聲波提取，抽濾，將濾液濃縮蒸干。用甲醇溶解濃縮物并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻得樣品液。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度的確定。

稱取木瓜粉5份，每份1 g，分別加入50 mL 30%、50%、70%、90%乙醇和無水乙醇，在30℃下超聲波提取40min，抽濾，將濾液濃縮蒸干。用甲醇溶解濃縮物并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻得樣品液。將樣品液用0.45μm微孔濾膜過濾，取20μL進樣分析。測得齊墩果酸含量與乙醇濃度的關系。

2.2.2 料液比的選擇[4]。

稱取木瓜粉5份，每份1 g，分別按料液比1∶50、1∶40、1∶30、1∶20和1∶10選取浸提溶劑的體積，在30 ℃下以無水乙醇超聲波提取40 min，抽濾，將濾液濃縮蒸干，以下操作同2.2.1，測得齊墩果酸含量與料液比的關系。

2.2.3 提取時間的選擇[5]。

稱取木瓜粉5份，每份1 g，加入50 mL無水乙醇，在30 ℃下超聲波分別提取20、30、40、50、60 min，抽濾，將濾液濃縮蒸干，以下操作同2.2.1，測得齊墩果酸含量與提取時間的關系。

2.2.4 溫度因素的選擇[5]。

稱取木瓜粉5份，每份1 g，加入50 mL無水乙醇，分別在30、40、50、60、70 ℃以無水乙醇超聲提取40 min，抽濾，將濾液濃縮蒸干，以下操作同2.2.1，測得齊墩果酸含量與提取溫度的關系。

2.3 超聲波提取工藝的優(yōu)化（Box-Behnken設計）

利用超聲波法提取木瓜中齊墩果酸的過程中,提取率的高低受多種因素的影響。根據(jù)本試驗前期的研究表明，提取溶劑的種類、濃度、提取溫度、超聲時間、料液比都會對提取率有一定程度的影響。經(jīng)比較，無水乙醇和甲醇較氯仿、丙酮提取率偏高，同時考慮到甲醇有毒，試驗選用無水乙醇作為提取溶劑。超聲波功率對齊墩果酸提取率影響不大，試驗中確定功率為600 W。在此基礎上，試驗應用相應面法中的Box-Behnken設計對提取溫度、料液比、超聲時間3個因素進行優(yōu)化。試驗設計借助Design Expert軟件，因素的水平及編碼如表1[7]。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平及編碼Table 1 Box-Behnken design experimental factor and coding

2.4 齊墩果酸的含量測定

2.4.1 色譜條件

Agilent 1100高效液相色譜儀；UV-2075紫外可見檢測器；HiQ Sil C18（4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相為甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（89∶11∶0.04∶0.02），流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：20μL。

2.4.2 線性關系考察

精密稱取齊墩果酸標準品適量，加入甲醇制成濃度為0.50 mg/mL的齊墩果酸標準液。將標準液濃度依次稀釋為0.25、0.1、0.05、0.025 mg/mL。將以上溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,在2.4.1色譜條件下進樣分析，測定峰面積。以齊墩果酸濃度為橫坐標（X），各濃度對應的峰面積（Y）為縱坐標作標準曲線，其回歸方程為：Y=2.306192e-007X，R2=0.99981。齊墩果酸的濃度在0.025 mg/mL～0.5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關系。

2.4.3 精密度、重現(xiàn)性及加樣回收率試驗

對標準品溶液重復進樣5次，每次20μL，齊墩果酸峰面積的RSD為0.25%。取樣品5份，按樣品液方法制備，在2.4.1色譜條件下進樣分析，根據(jù)峰面積計算出齊墩果酸的RSD為1.34%。稱取已測得齊墩果酸含量的木瓜粉末3份，每份1 g，3份分別加入齊墩果酸標準品5.0、10.0、15.0 mg，按樣品液方法制備后測定含量，結(jié)果齊墩果酸平均加樣回收率為98.2%。說明在樣品處理過程中齊墩果酸損失量少、重現(xiàn)性好，儀器精密度高，方法可行。

2.4.4 樣品液的測定

將2.1中樣品液用0.45μm微孔濾膜過濾，在上述色譜條件下取20μL進樣。根據(jù)標準曲線，用外標法對木瓜中齊墩果酸的含量進行定量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 響應面數(shù)值分析結(jié)果

Box-Behnken設計方案及所得試驗結(jié)果如表2。其中A，B，C分別對應提取溫度、料液比和超聲時間的因素水平值，響應值為對應提取條件下齊墩果酸的含量。

表2 Box-Behnken設計及試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experiment result

利用Design-Expert軟件，對上表數(shù)據(jù)進行二次多項擬合，得到齊墩果酸提取率與提取溫度、料液比、超聲時間三因素之間的三元非線性回歸方程:

式中：Y為齊墩果酸含量；A，B，C分別為上述三因素的編碼值。

3.2 回歸方程各項的方差分析結(jié)果

回歸方程各項的方差分析結(jié)果，如表3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance table

從方程的方差分析表3可以看出，試驗所選用模型顯著（P<0.05）,擬合度好。方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明，因素B和C對齊墩果酸含量的線性效應顯著，BC對齊墩果酸含量的交互效應影響顯著，其余因素影響不顯著，具體見表4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Regression equation significance test

3.3 等高線圖和響應面圖分析結(jié)果

通過回歸方程所做的等高線與其對應的響應面圖見圖1，比較3圖可知：料液比、超聲時間對齊墩果酸提取率的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，其最佳值分別在1∶16和45 min左右。而提取溫度對齊墩果酸提取率的影響不大，表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其含量的增加或減少，響應值變化很小，其最佳值約為53℃。

圖1 等高線與其對應的響應面圖Fig.1 Contour line and response surfaces

綜合響應面數(shù)值與等高線圖分析，在點（0.31307，0.36616，0.53066）處響應值有最大值，也就是說用無水乙醇作溶劑，在溫度為53.13℃、料液比為1∶16.83、提取時間為45.31 min時，齊墩果酸提取率最高。為方便操作，選擇溫度53 ℃，料液比為1∶16，時間為45 min，在此條件下重復操作3次，齊墩果酸平均提取率達到1.40 mg/g，也說明了試驗設計方法的科學合理性。

4 結(jié)論與討論

1）目前齊墩果酸含量測定的方法多用比色法、薄層色譜掃描法[8-9]，本文用高效液相色譜法測定木瓜果實中的齊墩果酸，方法操作簡單、靈敏、重現(xiàn)性好，可以用來對木瓜藥材中齊墩果酸的含量進行測定。試驗過程中對比了不同的流動相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-0.5%醋酸銨、甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺溶液[10]等多種流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（89∶11∶0.04∶0.02）作流動相，同時控制流速0.8 mL/min、柱溫30℃、檢測波長210 nm、進樣量20μL，齊墩果酸與其它峰的分離度較高，可得到滿意的色譜圖。

2）響應面法需要的試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高,并且它能同時研究幾種因素間的交互作用。經(jīng)響應面法優(yōu)化得出，木瓜中齊墩果酸的最佳超聲提取條件為：溫度為53℃，料液比為1∶16，提取時間為45 min。通過驗證試驗，在此條件下齊墩果酸的提取率達到1.40 mg/g。

3）試驗結(jié)果表明，木瓜果實中含有生理活性物質(zhì)—齊墩果酸，含量達0.14%。我國木瓜資源豐富，因此可以對木瓜果實中的齊墩果酸進行提取分離，開發(fā)生產(chǎn)具有保健功能的食品、藥品，以滿足市場需求，同時也可為生產(chǎn)企業(yè)和地方發(fā)展帶來較好的經(jīng)濟效益和社會效益。

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