倪建成，呂述權(quán)，丁 驍，譚慶偉

(1．福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002;2．福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建福州350002)

小葉女貞(Ligustrum quihoui Carr．)又名小白蠟，為木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum)植物，主要分布于我國華北、華中和西南地區(qū)。其葉入藥，具清熱解毒等功效，治燙傷、外傷，樹皮入藥治燙傷。近年來的研究表明，小葉女貞提取物具有顯著的增強(qiáng)機(jī)體免疫力、止咳平喘及清除自由基等作用(韓兆東等，2008;邱世翠等，2003;楊肇亨等，1996;徐向田，2009;洪新，1995)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

小葉女貞葉采自福建農(nóng)林大學(xué)校園，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)植保學(xué)院歐陽明安研究員鑒定;銅綠假單胞菌PAO1由中科院城市環(huán)境研究所饋贈;人肝癌細(xì)胞系BEL-7404由福建協(xié)和醫(yī)院肝膽研究所提供。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 小葉女貞葉片提取物的制備及初步分離 干燥小葉女貞葉片(5 kg)，采用煎煮法，煮沸30 min，取煎煮液合并，減壓濃縮得到粗提物。將粗提物用適量水溶解，采用大孔吸附樹脂D101除糖后，通過干柱層析(100-200目硅膠，氯仿/甲醇/水=8:2:0．2)，TLC檢測合并相同流分得到 Fr．1-Fr．6 共 6 個(gè)組分。

1．2．2 抗菌活性檢測 將小葉女貞葉片提取物用MH培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的供試溶液，過濾除菌后，4℃密封保存，備用。采用微量肉湯稀釋法，參考NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，對小葉女貞葉提取物抗菌活性進(jìn)行評價(jià)。以在孵育24 h和48 h小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度分別為MIC和MBC。

1．2．3 體外細(xì)胞毒性測定 采用MTT法(Twentyman PR et al．，1989)測定樣品對人肝癌細(xì)胞系BEL-7404增殖的抑制作用。將小葉女貞葉片提取物用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成不同濃度的溶液，每樣品6個(gè)重復(fù)，設(shè)置陽性對照(5-Fu，50 g/mL)，陰性對照(單細(xì)胞懸液)和空白對照(細(xì)胞培養(yǎng)液)。用酶標(biāo)儀測定570 nm波長下吸光值，并計(jì)算抑制率，參照如下公式:

抑制率%=［1-(OD處理-OD空白)/(OD對照-OD空白)］×100

其中OD處理為處理組吸光度的平均值;OD對照為陰性對照組吸光度平均值;OD空白為空白對照組吸光度平均值。

1．2．4 DPPH自由基清除作用的檢測 DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇水溶液呈很深的藍(lán)紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，其顏色的變化隨被清除的程度而變化，通過測量517 nm處的吸光度可以動態(tài)監(jiān)測DPPH自由基被清除的效果。

根據(jù) Jamila等方法(Jamila HS et al．，2011)，稱取3．9 mg DPPH，加入100 mL無水乙醇配成0．1 M DPPH溶液;取潔凈的并作避光處理的10 mL離心管，樣品組加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL的DPPH溶液，陰性對照為2 mL的DPPH溶液，空白對照為2 mL的含樣品溶劑，以相同體積的抗壞血酸(VC)溶液代替待測樣品陽性對照組，每樣品6次重復(fù);將離心管置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱避光振蕩，然后通過酶標(biāo)儀測定517 nm處的吸光度。

DPPH清除率%=(1-OD處理/OD空白)×100

其中OD處理為不同濃度各組分處理吸光度的平均值;OD對照為陰性對照組吸光度的平均值;OD空白為空白對照組吸光度的平均值。

2 結(jié)果與分析

2．1 抗菌活性

小葉女貞對銅綠假單胞菌PAO1有一定的抑制作用，12 h內(nèi)，5 mg/mL即可抑制其生長;24 h后，8 mg/mL濃度時(shí)，肉眼可見沒有細(xì)菌的生長，可表明小葉女貞對銅綠假單胞菌PAO1的MIC為8 mg/mL。經(jīng)過36 h和48 h的培養(yǎng)后，9 mg/mL時(shí)，細(xì)菌的生長繼續(xù)受到抑制，由此可以得出，小葉女貞粗提物溶液的MBC為9 mg/mL。

對小葉女貞葉片提取物初步分離得到的各組分Fr．1-Fr．6進(jìn)行抗菌活性檢測，結(jié)果(表1)表明，培養(yǎng)12 h，2 mg/mL濃度處理下，F(xiàn)r．1表現(xiàn)出抑菌活性，其余部分都有菌生長;培養(yǎng)24 h，F(xiàn)r．1 在4 mg/mL 時(shí)有抑菌活性，MIC 為4 mg/mL;培養(yǎng)36 h，F(xiàn)r．1 在6 mg/mL 表現(xiàn)出抑菌活性，其余部分都喪失抑菌活性;培養(yǎng)48 h，F(xiàn)r．1在6 mg/mL仍表現(xiàn)出抑菌活性。由此確定了小葉女貞對銅綠假單胞菌PAO1的抑制活性組分為低極性組分Fr．1。

2．2 抗腫瘤活性

采用MTT法測試小葉女貞葉粗提物和以及初步分離得到的6個(gè)組分 Fr．1-Fr．6 對人肝癌細(xì)胞 BEL-7404細(xì)胞毒活性。結(jié)果(圖1)表明，粗提物對人肝癌細(xì)胞BEL-7404體外增殖具有明顯的抑制作用，供試濃度0．6 mg/mL時(shí)，抑制率仍達(dá)到94．2%，但在 0．4 mg/mL 劑量下抑制效果減弱，抑制率為62．9%。

表1 小葉女貞提取物各組分對銅綠假單胞菌PAO1抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of Fr．1-Fr．6 against PAO1

Fr．1 顯示出較高的活性(圖2)，在 0．4 mg/mL 劑量下，抑制率為91．3%，在0．2 mg/mL 劑量作用下，抑制率仍達(dá)到87．8%，同等條件作用下，陽性對照(50 μg/mL的5＇-Fu)抑制率為95．1%。上述結(jié)果顯示，小葉女貞葉片提取物具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，對其活性組分有必要進(jìn)一步研究。

圖1 小葉女貞葉片粗提物細(xì)胞毒活性(BEL-7404)Figure 1 Cytotoxicity of aqueous extract of Ligustrum quihoui leaves

圖2 小葉女貞不同組分細(xì)胞毒活性(BEL-7404)Figure 2 Cytotoxicity of Fr．1-Fr．6 against BEL-7404

2．3 抗氧化活性

設(shè)置濃度梯度，分別測定VC、小葉女貞粗提物及各部分對DPPH自由基的體外清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)小葉女貞粗提物具有較高的DPPH自由基清除能力，同陽性對照VC相比，小葉女貞粗提物清除率略低于 VC，但隨著濃度的增加，兩者清除率幾乎相當(dāng)，在500 μg/mL時(shí)，清除率在96%左右(VC為96．6%，小葉女貞葉片提取物為95．4%)。

干柱層析得到的小葉女貞各組分對DPPH自由基仍保持較高的清除活性(圖4)，在250 μg/mL時(shí)，F(xiàn)r．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分別 89．5% 、88．9% 、92．7% 、92．9% 、93．6%;在 50 μg/mL時(shí)，F(xiàn)r．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分別 87．3% 、84．3% 、88．1% 、85．0% 、32．5% ，除了Fr．6清除率下降之外，其他組分基本上與同濃度的粗提物相當(dāng)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及上述結(jié)果可推測，小葉女貞對DPPH自由基具有清除作用的活性物質(zhì)為多種化合物，一種可能是不同結(jié)構(gòu)類型的化合物，另一種是同種結(jié)構(gòu)類型的不同衍生物，并且相互之間可能會有相互協(xié)同作用。

圖3 小葉女貞粗提物和VC清除DPPH自由基作用Figure 3 DPPH free radical scavenging activity of VCand leave extract from Ligustrum quihoui

圖4 小葉女貞不同組分對DPPH自由基清除能力Figure 4 DPPH free radical scavenging activity of Fr．1-Fr．6

3 小結(jié)與討論

女貞屬植物作為中藥應(yīng)用已有2000年的歷史，實(shí)載于《神農(nóng)本草經(jīng)》我國民間常采其鮮嫩枝葉搗爛敷于傷口上，以防止感染。現(xiàn)代諸多研究發(fā)現(xiàn)，女貞屬植物多種次生代謝產(chǎn)物具有不同的藥用活性，如齊墩果酸、熊果酸(三萜類化合物)具有抗腫瘤活性，橄欖苦甙等具有利尿作用，一些裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和黃酮類具有抗氧化活性。

本研究證實(shí)小葉女貞葉片提取物具有抗菌、抗腫瘤以及抗氧化作用，有必要對其活性成分進(jìn)行分離鑒定;并且通過對粗提物粗分和活性跟蹤測試初步確定了小葉女貞的藥理活性組分，這為我們進(jìn)一步研究其活性成分提供了依據(jù)。

韓兆東，阮月芹，宋月雁，侯佃臻，孫豐潤，孔祥華．2008．小葉女貞對免疫功能損傷小鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用．濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，31(4):258-261．

洪新，楊肇亨，周向東．1995．小葉女貞提取物-M2自由基清除劑作用的實(shí)驗(yàn)研究．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，17(4):341-342．

邱世翠，孫豐潤，韓兆東，張群，王志強(qiáng)．2003．小葉女貞對小鼠骨髓細(xì)胞增殖和IL-1的影響．中國中醫(yī)藥科技，10(4):230-231．

徐向田．2009．復(fù)方小葉女貞茶調(diào)節(jié)大鼠血脂和影響動物體重實(shí)驗(yàn)研究．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，27(8):1749-1750．

楊肇亨，周向東，洪新，段緒偉，謝義霞，王志強(qiáng)．1996．靜脈注射小葉女貞提取物M2對67例慢性阻塞性肺疾患患者的止咳、平喘作用分析．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，18(2):138-139．

Jamila HS，Isabelle C，Christelle HS，Cédric P，Michel F，Catherine H．2011．Biological activities of flavonoids from Nitraria retusa(Forssk．)Asch．a(chǎn)nd their acylated derivatives．Food Chemistry，124:486-494．

Twentyman PR，F(xiàn)ox NE，Rees JK．1989．Chemosensitivity testing of fresh leukemia cells using the MTT colorimetric assay．British Journal of Haematology，71:19-22．