嚴(yán)石林，沈宏春，2，王浩中，魯法庭，于宏波，陳 為，陶 怡

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075;2．瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000;3．云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500)

1 資料與方法

1.1 資料來源

病例資料來源于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院。從2009年3月至2010年7月期間符合診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)者，共收集慢性腎炎、糖尿病腎病、陽痿病3個(gè)病種典型腎陽虛證患者9例，分別抽取血樣標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

抽取實(shí)驗(yàn)者空腹靜脈血10mL，裂解紅細(xì)胞，分離獲得白細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。將總RNA進(jìn)行IVT體外擴(kuò)增，采用cy－3標(biāo)記擴(kuò)增后的cDNA，單標(biāo)法與agilent4*44k人類全表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，洗脫、干燥、數(shù)據(jù)提取、歸一化處理。

1.2.1 分組

共分為4組，分別為慢性腎炎、糖尿病腎病、陽痿病3個(gè)實(shí)驗(yàn)組共9例，健康對照組共3例。

2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

使用SAM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 差異表達(dá)基因篩選

數(shù)據(jù)全部錄入SAS系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采用DiffGene方法，分別將慢性腎炎腎陽虛組與正常組比較得到1435條差異表達(dá)基因，將糖尿病腎病腎陽虛組與正常組比較得到2306條差異表達(dá)基因，將陽痿腎陽虛組與正常組比較得到2060條差異表達(dá)基因。為了找到3種不同疾病腎陽虛組在腎陽虛證方面的共同生物學(xué)特征，我們把3組數(shù)據(jù)錄入EXCEL工作表，采用高級(jí)篩選功能進(jìn)行兩兩篩選，最后找出332條共同差異表達(dá)基因，其中有注釋的基因?yàn)?81條。

采用Pathway分析，發(fā)現(xiàn)3組間差異表達(dá)顯著的信號(hào)通路有37條。分別是腎細(xì)胞癌，氨酰－tRNA生物合成，Notch信號(hào)通路，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，在癌細(xì)胞中協(xié)調(diào)促進(jìn)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的核染質(zhì)重塑的復(fù)合物與共激動(dòng)劑的活性，Pitx2基因轉(zhuǎn)錄的多步校正，MEF2D在T細(xì)胞凋亡的作用，胰島素信號(hào)通路，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號(hào)通路，丙酮酸代謝，賴氨酸降解，阻止肉毒菌毒素引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，非小細(xì)胞肺癌，前列腺癌，ps1簇淀粉樣的b－縮氨酸，mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號(hào)通路，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，丙酸代謝，腫瘤通路，基本轉(zhuǎn)錄因子，代謝途徑，心血管系統(tǒng)中低氧可誘導(dǎo)因子，TGF－β信號(hào)通路，Wnt信號(hào)通路，g－分泌素介導(dǎo)的ErbB4信號(hào)通路，阿爾茨海默病，PPAR信號(hào)通路，黑色素細(xì)胞及色素沉著通路，Pelp1雌激素受體活性調(diào)節(jié)，精子生成的肌酸酐調(diào)控，新型冠狀病毒的生命周期，磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)，DREAM轉(zhuǎn)錄調(diào)控鎮(zhèn)痛，PPAR－gamma復(fù)合激動(dòng)劑在肥胖和產(chǎn)熱過程中的作用，SODD/TNFR1信號(hào)通路，CARM1甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，甘油磷酸酯代謝。

3.2 每組樣本特有的差異表達(dá)基因結(jié)果

通過篩選功能，我們還得到每組樣本所特有的差異表達(dá)基因。從這些差異表達(dá)基因中，找尋出同為腎陽虛證這一生物學(xué)意義下的不同點(diǎn)。數(shù)據(jù)處理示意圖見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)篩選示意圖

3組病例都包含腎陽虛證，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理后找出了腎陽虛證的共同差異表達(dá)基因。但是，3組樣本來至不同疾病，所以存在不同的生物學(xué)意義。通過對各病所特有的基因進(jìn)行分析后，除發(fā)現(xiàn)大部分基因與本身的疾病有關(guān)外，卻又驚奇發(fā)現(xiàn)有一小部分基因參與了共同差異表達(dá)基因里面的3條信號(hào)通路，具體結(jié)果如下:

3.2.1 mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號(hào)通路

是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可整合細(xì)胞外信號(hào)，磷酸化下游靶蛋白核糖體p70S6激酶，如S6K1及4E－BP1，影響基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)翻譯，從而參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖等過程。該通路與糖尿病腎病的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TSC－mTOR通路之一，即PI3K－Akt－TSCI/2－mTOR信號(hào)通路可能參與系膜肥大增殖。如PI3K－Akt－TSCI/2－mTOR在生長停滯特異性基因6(Growtharrest．specificgene6)誘導(dǎo)系膜和腎小球肥大過程中起重要作用，雷帕霉素可阻斷PI3K－Akt－TSCI/2－mTOR通路活化和系膜肥大［1］。Komers等報(bào)告，PI3K－Akt－TSCI/2－mTOR路還可通過調(diào)節(jié)mTOR主要的下游分子p70S6K和elF－4E的表達(dá)，引起DN的腎臟肥大［2］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3組腎陽虛的共同特征是PDK1調(diào)控PI3KAkt－TSCI/2－mTOR通路，通過PP2A調(diào)控磷酸化下游靶蛋白核糖體p70S6激酶，如S6K1及4EBP1。糖尿病腎病組在該通路中還存在差異基因FKBP12，直接通過雷帕霉素調(diào)控mTOR信號(hào)通路(見圖2)。也就是說在糖尿病腎病腎陽虛證在mTOR信號(hào)通路上與健康組有3個(gè)位點(diǎn)存在差異表達(dá)，而在3組腎陽虛證共有的特征中僅有2個(gè)位點(diǎn)有差異，這就決定了在治療上有所不同。

3.2.2 Notch信號(hào)通路

廣泛存在于多種動(dòng)物體內(nèi)，在進(jìn)化過程中高度保守，主要介導(dǎo)細(xì)胞的分化抑制信號(hào)，在胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育、腫瘤形成等生理病理過程中起重要作用。

3組病例在notch信號(hào)通路中共同的差異表達(dá)基因有:MAML1(mastermind－like1)、EP300(E1Abindingproteinp300)，見圖3。

MAML1:有證據(jù)表明人類在體外homolog形成一個(gè)復(fù)雜的人類細(xì)胞內(nèi)的部分缺口受體和可以增加表達(dá)Notch－induced基因。此證據(jù)支持這個(gè)提議的功能相當(dāng)于一個(gè)co－activator切口轉(zhuǎn)錄在信號(hào)傳導(dǎo)途徑。有證據(jù)表明它是該通路的一個(gè)催化劑。

EP300(E1Abindingproteinp300)它的功能是通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄核染質(zhì)的再塑造和重要過程中細(xì)胞的增生和分化?？梢哉{(diào)節(jié)cAMP－gene結(jié)合具體的調(diào)節(jié)蛋白磷酸化CREB。這個(gè)基因也被認(rèn)定為缺氧因子1a的催化劑復(fù)合物，因此就在如血管內(nèi)皮生長因子等缺氧誘導(dǎo)基因中扮演了一個(gè)重要角色。

上述表明，腎陽虛證在notch信號(hào)通路中通過在基因MAML1、EP300表達(dá)下調(diào)，降低了對細(xì)胞增殖和分化的催化作用，使與該通路相關(guān)的胚胎發(fā)育、血細(xì)胞發(fā)育降低，骨髓細(xì)胞生成減少。這種作用與中醫(yī)描述的腎藏精、主骨生髓的生理功能非常相似。腎藏先天之精，靠后天滋養(yǎng)，人體的生長發(fā)育與之密切相關(guān);腎主骨，骨生髓、髓能生血;當(dāng)人體出現(xiàn)在腎陽虛的病理狀態(tài)下時(shí)，就可能導(dǎo)致小兒生長發(fā)育遲緩，髓不能生血出現(xiàn)血液虧虛，腎的這一生物學(xué)機(jī)制可能與notch信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)。

然而在陽痿腎陽虛組中我們發(fā)現(xiàn)在Notch通路中還存在CIR1(corepressor interacting with RBPJ1)和DVL3表達(dá)有差異，二者均是起負(fù)反饋?zhàn)饔?。所以對陽痿腎陽虛證的治療不同于其他疾病腎陽虛證的治療，可能是在于對CIR1和DVL3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)上。

3.2.3 Wnt信號(hào)通路

Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt信號(hào)途徑能引起胞內(nèi)β－連鎖蛋白 (β－catenin)積累。β－catenin是一種多功能的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞連接處它與鈣黏素相互作用，參與形成黏合帶。而游離的β－catenin可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。正常機(jī)體腎臟中Wnt信號(hào)是“沉默”的，胞質(zhì)中僅有少量游離態(tài)的β－catenin，體內(nèi)絕大多數(shù)β－catenin在胞膜處與E－cadherin形成復(fù)合體，對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的遷移發(fā)揮作用。Surendran等［3］利用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法造成大鼠腎小管間質(zhì)性腎纖維化模型，發(fā)現(xiàn)wnt4在集合管中有表達(dá)伴隨集合管周圍纖維化形成，間質(zhì)成纖維細(xì)胞wnt4高水平表達(dá)與I型膠原mRNA及a－sMA的高表達(dá)一致;體外實(shí)驗(yàn)表明Wnt4可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞β－catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。提示W(wǎng)nt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在腎臟纖維化中發(fā)揮著重要作用。慢性腎炎腎陽虛證組與腎陽虛證共同特征的差異在于，前者通過CAMK2G還參與了Wnt蛋白介導(dǎo)的Wnt5/Ca2+通路 (如圖4)。CAMK2G是屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族4種亞基之一，在Ca2+通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4 Wnt信號(hào)通路示意圖

4 討論

本次研究通過基因篩選，發(fā)現(xiàn)慢性腎炎、糖尿病腎病、陽痿等3種疾病的腎陽虛證除各有不同的差異表達(dá)基因外，還有共同的差異表達(dá)基因332條，其中有注釋的基因?yàn)?81條。并通過轉(zhuǎn)錄組特征分析，發(fā)現(xiàn)與腎陽虛證相關(guān)的共同信號(hào)通路37個(gè)。說明不同疾病除具備各自特征的信號(hào)通路調(diào)控基因外，還具有共同的信號(hào)通路調(diào)控，為中醫(yī)“異病同證”、“異病同治”的經(jīng)典論述從分子生物學(xué)的角度找到理論依據(jù)。

本次研究從每組樣本特有的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)有mTOR、notch、Wnt等3條信號(hào)通路與腎陽虛證共有的信號(hào)通路一致，只是在通路的調(diào)控上有基因表達(dá)差異。

其中糖尿病腎病腎陽虛組在mTOR信號(hào)通路中存在差異基因FKBP12，直接通過雷帕霉素調(diào)控該信號(hào)通路;陽痿腎陽虛組中發(fā)現(xiàn)在Notch通路中存在CIR1(corepressor interacting with RBPJ1)和DVL3表達(dá)有差異;慢性腎炎腎陽虛組通過CAMK2G的差異表達(dá)調(diào)控Wnt信號(hào)通路。以上說明，3種不同疾病，同有腎陽虛證，雖然有共同的信號(hào)通路，即反應(yīng)于外的大證相同，但因受不同疾病的影響，同一信號(hào)通路的調(diào)控基因有所差異，其細(xì)證的表現(xiàn)和病機(jī)也有所差異，這些表達(dá)差異基因有可能決定了治療上的差異。這一研究結(jié)果，為我們提出“同證異治”的創(chuàng)新治法觀點(diǎn)提供了分子生物學(xué)依據(jù)。由此可以認(rèn)為，中醫(yī)在辨證論治的時(shí)候，應(yīng)高度重視疾病對證候的影響，必須“從病辨證”。不僅要嚴(yán)格遵循“異病同證”， “同證同治”的傳統(tǒng)經(jīng)典論述。還要重視疾病對證候的影響，參照“異病同證”，“同證異治”這一對傳統(tǒng)治法的補(bǔ)充和完善的創(chuàng)新理念，才能提高辨證論治的水平。

［1］ NagaiK，MatsubaraT，MimaA，eta1．Gas6 induces Akt/mTOR－mediated mesangial hypertrophy in diabetic nephropathy［J］．KidneyInt，2005，68(2):552－561．

［2］HiroyukiM，InokiK，KohsukeM，eta1．The mTOR pathway is highly activated in diabetic nephropathy and rapamycin has a strong therapeutic potential［J］．Bloc and Biop ResCom，2009，384(105):471－475．

［3］ SurendranK，Schiavi，HruskaKA．Wnt－ dependentbeta－catenin signaling is activated after unilateralureteral obstruction and recombinant secreted frizzledrelated protein4 alters the progression of renal fibrosis［J］．JAmSocNephrol，2005，16(8):2373 －2384．