毛桂福

（柳州市婦幼保健院藥劑科，廣西柳州 545001）

丙戊酸體內(nèi)分析方法研究進(jìn)展Δ

毛桂福＊

（柳州市婦幼保健院藥劑科，廣西柳州 545001）

目的：綜述丙戊酸的體內(nèi)分析方法，為丙戊酸的臨床藥學(xué)研究提供方法學(xué)參考。方法：通過(guò)查閱大量國(guó)內(nèi)、外文獻(xiàn)，總結(jié)了常用儀器分析方法在丙戊酸體內(nèi)分析中的應(yīng)用進(jìn)展。結(jié)果：丙戊酸體內(nèi)藥物濃度的分析方法有多種，常用有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法和熒光偏振免疫分析法等。結(jié)論：目前最常用的分析方法為熒光偏振免疫分析法和高效液相色譜法；隨著液質(zhì)聯(lián)用儀的普及，分離效率高、分析速度快的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)有望成為血藥濃度監(jiān)測(cè)的主要方法。

丙戊酸；體內(nèi)分析；高效液相色譜法；液質(zhì)聯(lián)用；氣相色譜法；高效毛細(xì)管電泳法；熒光偏振免疫分析法；均相酶免疫分析法

丙戊酸（Valproic acid，VPA）是一種廣譜抗癲癇藥，對(duì)全身性癲癇的失神發(fā)作、肌陣攣發(fā)作和強(qiáng)直性陣攣發(fā)作有效，對(duì)單純部分性發(fā)作和復(fù)雜性部分發(fā)作也有一定療效。VPA的治療濃度范圍窄、個(gè)體差異大，治療過(guò)程中須監(jiān)測(cè)血藥濃度，以達(dá)到個(gè)體化合理用藥之目的。VPA分子無(wú)特征性的紫外吸收，其血藥濃度的測(cè)定一直是體內(nèi)藥物分析的難點(diǎn)。本文系統(tǒng)歸納了現(xiàn)有的VPA分析方法，特別是對(duì)衍生化高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

1 HPLC法

HPLC法是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種定量分析方法，具有準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在藥物的體內(nèi)分析領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。由于VPA分子結(jié)構(gòu)缺乏生色基團(tuán)，HPLC法監(jiān)測(cè)VPA的血藥濃度，大多需要將VPA柱前衍生化生成具有紫外吸收或熒光的酯類，再用紫外檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器等檢測(cè)。常用的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)有248、254、262、300 nm等。不經(jīng)過(guò)柱前衍生化處理而直接測(cè)定的高效液相色譜-紫外檢測(cè)（HPLC-UV）法[1]報(bào)道較少。

血樣中VPA通常采用液-液萃取法提取。由于VPA的p Ka值為4.95，血樣一般需用硫酸或鹽酸等酸化處理。常用的萃取溶劑有正戊烷、正己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷和乙腈等，或它們的混合溶劑。衍生化后的溶液經(jīng)固相萃取法處理，可除去反應(yīng)液中殘余的衍生化試劑，減少衍生化試劑對(duì)測(cè)定的干擾，有利于色譜柱的保護(hù)。

柱前衍生化-HPLC法測(cè)定血清中VPA，通常采用C18柱，以甲醇-水或乙腈-水等二元流動(dòng)相進(jìn)行分離，并常用環(huán)己烷羧酸、1-環(huán)己烷烯羧酸、正庚酸、辛酸、壬酸、十一碳烯酸等作內(nèi)標(biāo)。該方法主要的區(qū)別是樣品預(yù)處理過(guò)程中衍生化方法的不同，各衍生化條件詳見(jiàn)表1。常用的衍生化試劑有α-溴苯乙酮、2，4′-二溴苯乙酮（DBrMP）、2-溴-對(duì)硝基苯乙酮、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）、4-溴甲基-6，7-二甲氧基香豆素（BrDMC）、N-（1-萘基）乙二胺和2-（2-萘氧基）乙基-2-（哌啶）乙磺酸酯等。衍生化試劑、催化劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及氮?dú)饬魉俚戎苯佑绊慥PA衍生物的生成，進(jìn)而影響VPA的測(cè)定[2，3]。常見(jiàn)的柱前衍生化-HPLC法分述如下。

1.1 α-溴苯乙酮衍生化法

付翠香等[2]用α-溴苯乙酮作衍生化試劑建立了HPLC法測(cè)定VPA血藥濃度。VPA濃度在15～200μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率、RSD都能滿足測(cè)定要求，最低檢測(cè)濃度為0.2μg·mL－1。三乙胺作為催化劑能中和反應(yīng)中生成的溴化氫，使VPA酯化完全。適當(dāng)增加衍生化試劑用量有助于增加VPA衍生物的生成量，但過(guò)多不利于色譜柱的保護(hù)。苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平等抗癲癇藥對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。該方法國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]較多，樣品處理方法大多類似。

1.2 DBr MP衍生化法

Chen等[5]用DBrMP作衍生化試劑建立了HPLC法測(cè)定血漿中VPA和主要代謝物2-丙基-4-戊烯酸的濃度。兩者分別在5～200μg·mL－1和0.5～20μg·mL－1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，最低定量限分別為5μg·mL－1和0.5μg·mL－1，日內(nèi)和日間RSD在－3.0%～7.5%范圍內(nèi)。

1.3 2-溴-對(duì)硝基苯乙酮衍生化法

表1 HPLC測(cè)定血清中丙戊酸的衍生化條件

石蘇英等[6]建立了測(cè)定VPA血藥濃度的HPLC法。血清樣品經(jīng)正己烷提取后，加入2-溴-對(duì)硝基苯乙酮在50℃水浴中放置15 min即可完成衍生化反應(yīng)。VPA的最低檢測(cè)限為0.2μg·mL－1，提取回收率為83.0%～86.3%。周莉華等[7]也采用2-溴-對(duì)硝基苯乙酮作衍生化試劑建立了HPLC法測(cè)定VPA的血藥濃度。

1.4 Br MMC衍生化法

陳湛芳等[8]采用BrMMC作衍生化試劑建立了HPLC-UV法測(cè)定VPA血清濃度。VPA的衍生化反應(yīng)需用含10 mg·mL－1碳酸鉀的冠醚混懸液催化，于65℃水浴避光反應(yīng)30 min。衍生物在－20℃避光儲(chǔ)放1周或室溫避光儲(chǔ)放72 h穩(wěn)定，血樣在－30℃凍存3個(gè)月基本穩(wěn)定。Gill等[9]以環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)、BrMMC為衍生化試劑，建立了HPLC-熒光法測(cè)定VPA血漿濃度，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為330 nm和395 nm。最低定量濃度為2.47μg·mL－1，批內(nèi)和批間RSD≤8.6%。并用該方法進(jìn)行了3種VPA腸溶片的生物等效性研究。

1.5 Br DMC衍生化法

趙俠等[10]通過(guò)用BrDMC與VPA衍生化，建立了HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定VPA的血藥濃度，衍生化需在60℃水浴中反應(yīng)40 min，冷卻后用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為325 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為398 nm。VPA的最低定量限為1 mg·L－1。該方法靈敏度高、專屬性好，并用于VPA口服溶液生物等效性的研究。

1.6 N-（1-萘基）乙二胺衍生化法

Kamalinia等[11]通過(guò)VPA與N-（1-萘基）乙二胺衍生化，建立HPLC法測(cè)定了VPA的血藥濃度。在100μL N，N′-二環(huán)己基碳酰亞胺（5 mg·mL－1）和N-羥基丁二酰亞胺（二者物質(zhì)的量之比為1∶3.6）的催化下，衍生化反應(yīng)于85℃水浴中保溫60 min即可完成。衍生物在室溫放置3 d仍穩(wěn)定；VPA在0.1～100μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為10 ng·mL－1。該方法比以往報(bào)道的HPLC-UV法和HPLC-熒光檢測(cè)法都靈敏，但反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)，且所用溶劑都需要經(jīng)過(guò)硫酸鈉干燥。

2 液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)

LC-MS技術(shù)是最近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新的分析方法，具有高效、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是需要昂貴的儀器設(shè)備和具有高技術(shù)水平的工作人員。楊學(xué)志等[12]建立LC-MS法測(cè)定人血清中VPA濃度：采用Zorbax SB C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5μm），以乙腈-水（60∶40）為流動(dòng)相，流速0.3 mL·min－1，柱溫30℃，血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后進(jìn)樣分析。采用電噴霧電離源（ESI）負(fù)離子源，用選擇離子監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行定量分析。VPA在0.5～100μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度為0.1μg·mL－1。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、耗時(shí)少，適用于VPA血藥濃度監(jiān)測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究。Gao等[13]和Matsuura等[14]也建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定人血中VPA或代謝物的濃度。

3 氣相色譜（GC）法

GC法是最早發(fā)展起來(lái)的一種儀器分析方法，具有分離效能高、靈敏度高、用樣量少等優(yōu)點(diǎn)。由于VPA具有一定的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，早期監(jiān)測(cè)其血藥濃度應(yīng)用GC法較多。張華年等[15]用程序升溫毛細(xì)管GC法監(jiān)測(cè)VPA血藥濃度。選用ATSE-54石英毛細(xì)管色譜柱（21 m×0.53 mm，1.0μm）為色譜柱，用火焰離子化檢測(cè)儀（FID）檢測(cè)VPA血藥濃度。VPA在20～300 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度為1 mg·L－1，相對(duì)回收率在96%以上，日內(nèi)和日間RSD＜7.6%。該方法不需要衍生化處理樣品，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，但一個(gè)測(cè)定周期仍需耗時(shí)1 h左右。Farajzadeh等[16]用固相微萃取毛細(xì)管GC法檢測(cè)人血中VPA的濃度，該方法線性范圍寬（0.25～100 mg·L－1），檢測(cè)限低（85μg·L－1），RSD＜7%。

4 高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法

HPCE法是近年來(lái)發(fā)展較快的一種新型高效快速的分離分析技術(shù)，具有分辨率和靈敏度高、快速、耗費(fèi)低、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。Belin等[17]以己酸為內(nèi)標(biāo)建立毛細(xì)管電泳法測(cè)定體液中VPA：血樣經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，采用石英毛細(xì)管柱（50μm×50 cm）分離，以10 mmol·L－12-（N-嗎啉代）乙磺酸/DL-組氨酸溶液（pH 6.0，含50μmol·L－1西曲溴銨）為電泳緩沖液，分離電壓30 kV，電泳時(shí)間3 min，虹吸方式進(jìn)樣10 s，電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果VPA在2～150μg·mL－1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)濃度為80 ng·mL－1。

5 熒光偏振免疫分析（FPIA）法

FPIA法具有自動(dòng)化程度高、不需要樣品處理、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外監(jiān)測(cè)血藥濃度選擇的主要方法。其缺點(diǎn)是設(shè)備、試劑價(jià)格較高。2010年孔晶等[18]對(duì)監(jiān)測(cè)VPA血藥濃度的FPIA法進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果表明平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差等符合《中國(guó)藥典》對(duì)生物樣品測(cè)定方法的規(guī)定。唐榮福等[19]用FPIA FLX法檢測(cè)了2～8℃冰箱中儲(chǔ)存不同時(shí)間的VPA血清樣品，結(jié)果表明，血清中VPA放置1周內(nèi)穩(wěn)定，放置2周后不穩(wěn)定。

6 均相酶免疫分析（EMIT）法

EMIT法是利用抗原（藥物）及標(biāo)記抗原（葡萄糖-6磷酸脫氫酶標(biāo)記的藥物）競(jìng)爭(zhēng)與抗體相互識(shí)別、結(jié)合來(lái)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的。EMIT法自動(dòng)化程度高、無(wú)需對(duì)樣品預(yù)處理，適用于急診及批量測(cè)定，但該法儀器和試劑成本較高。黃文鶯等[20]以EMIT法采用全自動(dòng)免疫分析儀測(cè)定了VPA血藥濃度，并與HPLC的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果VPA在1～150 mg·L－1濃度范圍內(nèi)時(shí)，HPLC和EMIT兩種方法的準(zhǔn)確度無(wú)顯著性差異，但HPLC法精密度更好；兩種方法測(cè)定結(jié)果存在高度相關(guān)性，但是當(dāng)測(cè)定標(biāo)本的VPA濃度小于10 mg·L－1時(shí)宜用HPLC法測(cè)定。

7 小結(jié)

目前，測(cè)定VPA血藥濃度最常用的方法是FPIA法和HPLC法。FPIA法具有簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，但需用專用儀器及試劑盒，耗費(fèi)較多，且VPA代謝產(chǎn)物對(duì)測(cè)定有干擾，該方法難于在基層醫(yī)院推廣使用。而HPLC法需要柱前衍生化，操作煩瑣，不適于大批量樣品測(cè)定；但HPLC儀在國(guó)內(nèi)較普及，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，因而該方法在基層單位仍廣泛應(yīng)用。衍生化試劑、催化劑、反應(yīng)溫度和時(shí)間以及氮?dú)饬魉俚扔绊慥PA衍生化反應(yīng)，因此需對(duì)這些因素進(jìn)行考察，從而確定最佳反應(yīng)條件，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。LC-MS法具有分離效率高、不需要衍生化處理等優(yōu)點(diǎn)，隨著LC-MS儀的普及，LC-MS法有望成為VPA血藥濃度監(jiān)測(cè)的主要方法。

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R914

A

1001-0408（2012）46-4393-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.28

2011-12-07

2012-06-11）