崔 潔，范英昌，薛 亮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是成體干細胞的一種，具有自我更新的能力與多向分化、增殖的潛能，在一定條件下可分化為多種組織細胞。具有自體獲得、易培養(yǎng)、移植后能長期存活且不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)、可被外源基因轉(zhuǎn)染并長期表達的優(yōu)點。近年來越來越引起人們的關(guān)注，成為組織工程、細胞治療、基因治療及器官移植的研究熱點，在多學(xué)科多領(lǐng)域作為一種理想的種子細胞得到了廣泛應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細胞雖然在體內(nèi)的來源比較廣泛，但數(shù)量極少。而組織工程與細胞工程開展的首要條件是種子細胞的獲取和傳代培養(yǎng)，如何能夠在體外獲得足夠數(shù)量和較高純度的種子細胞極其重要。通過本研究擬建立一種體外分離培養(yǎng)、擴增骨髓間充質(zhì)干細胞的理想方法，并觀察其生長特性，探討其鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7周齡健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心，動物許可證號為SCXK（2005-0001）。

1.1.2 主要試劑 特級胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司），胰蛋白酶（1∶250，美國 Hyclone公司），Percoll（Parmacia），乙二胺四乙酸（EDTA，天象人生物技術(shù)研究所），青霉素、鏈霉素（Hyclone），D-Hank液（南京化學(xué)試劑廠），CD44兔多克隆抗體，CD43兔多克隆抗體，PBS緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離、原代培養(yǎng)方法 取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，再用適量D-Hank液反復(fù)沖洗骨髓腔，100目篩網(wǎng)過濾，采用Percoll分離液，行密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，將密度為1.073g/mL的Percoll預(yù)先置于試管的底部，然后按照1∶1的比例沿管壁緩慢滴加骨髓懸液，離心（1800 r/min，20 min），分離出位于界面層灰白色的單個核細胞，用L-DMEM（含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）離心洗滌 2次（800 r/min，5 min）。以3.0×105/cm2的密度接種于完全培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d更換新鮮的培養(yǎng)液。

1.2.2 MSCs的傳代培養(yǎng)方法 待細胞接近80%鋪滿瓶底，將原代細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液棄去，用D-Hank液沖洗2次，以去除培養(yǎng)液中的血清，加入0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化細胞，顯微鏡下控制消化時間。當(dāng)細胞收縮變圓時，立即加入含少量血清的培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管輕輕吹打細胞，收集細胞懸液，離心（800 r/min，5 min），棄上清液。加入完全培養(yǎng)液充分吹打成單細胞懸液，而后按1∶3傳代接種于75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細胞鋪滿瓶底后，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代增殖。

1.2.3 MSCs的鑒定 采用聯(lián)合檢測陽性和陰性表達的抗原作為鑒定方法。選用生長狀況良好的第3代（P3代）MSCs，用鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測細胞表面抗原CD44和CD34的表達。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs的形態(tài)學(xué)觀察 接種4 h后，可見細胞貼壁生長，24 h后可見貼壁的MSCs大部分為紡錘狀的成纖維細胞樣外觀。原代培養(yǎng)3 d后，細胞開始呈集落樣生長，增殖加快，呈多種形態(tài)，主要為成纖維細胞樣外觀，細胞呈梭形或星形，體積較小，隨著繼續(xù)培養(yǎng)，細胞體積逐漸增大，大約14 d后可基本鋪滿瓶底。

2.2 MSCs表面蛋白的表達 MSCs免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達。陽性細胞胞漿內(nèi)含棕黃色、顆粒狀物質(zhì)（見圖1、圖2）。表明本實驗獲得的細胞為骨髓間質(zhì)來源的干細胞。

圖1 MSCs CD44染色陽性×400Fig.1 CD44staining positive MSCs×400

圖2 MSCs CD34染色呈陰性×400Fig.2 CD34staining negative MSCs×400

3 討論

3.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)方法 根據(jù)密度梯度從骨髓中離心出單個核細胞層，培養(yǎng)于體積分數(shù)為10%的胎牛血清中，根據(jù)MSCs易于貼附于塑料制品的特性進一步純化分離。培養(yǎng)初期可能有少數(shù)造血細胞貼壁，但隨著換液及傳代，最后只留下能貼壁的成纖維細胞樣的細胞，這即為最終獲得的MSCs。

3.2 MSCs的細胞表面分子標記 目前尚無MSCs的特異性標志，對MSCs的特征描述及其分離方法都是以一個細胞群體的形式進行的，可表達多種表面標記物，CD44是MSCs的重要標志物，而MSCs不表達造血細胞表面抗原，如造血前體細胞標志抗原CD34。本實驗結(jié)果顯示，P3代MSCs不表達抗原CD34，表達抗原CD44，符合MSCs的表面標志物特征。

4 結(jié)論

本實驗采用密度梯度離心法從骨髓中離心出單個核細胞層，結(jié)合貼壁培養(yǎng)法進行體外培養(yǎng)擴增，細胞生長狀態(tài)良好，體外增殖能力較強。通過鑒定細胞表面抗原標志，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，證實研究中所分離培養(yǎng)細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞。本實驗所采用的骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)方法簡便、快捷、可靠，可用于后期實驗研究。

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