崔 潔，范英昌，薛 亮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是成體干細(xì)胞的一種，具有自我更新的能力與多向分化、增殖的潛能，在一定條件下可分化為多種組織細(xì)胞。具有自體獲得、易培養(yǎng)、移植后能長(zhǎng)期存活且不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)、可被外源基因轉(zhuǎn)染并長(zhǎng)期表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)越來(lái)越引起人們的關(guān)注，成為組織工程、細(xì)胞治療、基因治療及器官移植的研究熱點(diǎn)，在多學(xué)科多領(lǐng)域作為一種理想的種子細(xì)胞得到了廣泛應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雖然在體內(nèi)的來(lái)源比較廣泛，但數(shù)量極少。而組織工程與細(xì)胞工程開展的首要條件是種子細(xì)胞的獲取和傳代培養(yǎng)，如何能夠在體外獲得足夠數(shù)量和較高純度的種子細(xì)胞極其重要。通過(guò)本研究擬建立一種體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想方法，并觀察其生長(zhǎng)特性，探討其鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 7周齡健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（2005-0001）。

1.1.2 主要試劑 特級(jí)胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclone公司），胰蛋白酶（1∶250，美國(guó) Hyclone公司），Percoll（Parmacia），乙二胺四乙酸（EDTA，天象人生物技術(shù)研究所），青霉素、鏈霉素（Hyclone），D-Hank液（南京化學(xué)試劑廠），CD44兔多克隆抗體，CD43兔多克隆抗體，PBS緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的分離、原代培養(yǎng)方法 取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨，再用適量D-Hank液反復(fù)沖洗骨髓腔，100目篩網(wǎng)過(guò)濾，采用Percoll分離液，行密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，將密度為1.073g/mL的Percoll預(yù)先置于試管的底部，然后按照1∶1的比例沿管壁緩慢滴加骨髓懸液，離心（1800 r/min，20 min），分離出位于界面層灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，用L-DMEM（含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）離心洗滌 2次（800 r/min，5 min）。以3.0×105/cm2的密度接種于完全培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每3 d更換新鮮的培養(yǎng)液。

1.2.2 MSCs的傳代培養(yǎng)方法 待細(xì)胞接近80%鋪滿瓶底，將原代細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液棄去，用D-Hank液沖洗2次，以去除培養(yǎng)液中的血清，加入0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化細(xì)胞，顯微鏡下控制消化時(shí)間。當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時(shí)，立即加入含少量血清的培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，離心（800 r/min，5 min），棄上清液。加入完全培養(yǎng)液充分吹打成單細(xì)胞懸液，而后按1∶3傳代接種于75 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳代增殖。

1.2.3 MSCs的鑒定 采用聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性和陰性表達(dá)的抗原作為鑒定方法。選用生長(zhǎng)狀況良好的第3代（P3代）MSCs，用鏈霉親和素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44和CD34的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs的形態(tài)學(xué)觀察 接種4 h后，可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，24 h后可見貼壁的MSCs大部分為紡錘狀的成纖維細(xì)胞樣外觀。原代培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞開始呈集落樣生長(zhǎng)，增殖加快，呈多種形態(tài)，主要為成纖維細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞呈梭形或星形，體積較小，隨著繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞體積逐漸增大，大約14 d后可基本鋪滿瓶底。

2.2 MSCs表面蛋白的表達(dá) MSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)。陽(yáng)性細(xì)胞胞漿內(nèi)含棕黃色、顆粒狀物質(zhì)（見圖1、圖2）。表明本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞為骨髓間質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞。

圖1 MSCs CD44染色陽(yáng)性×400Fig.1 CD44staining positive MSCs×400

圖2 MSCs CD34染色呈陰性×400Fig.2 CD34staining negative MSCs×400

3 討論

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 根據(jù)密度梯度從骨髓中離心出單個(gè)核細(xì)胞層，培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清中，根據(jù)MSCs易于貼附于塑料制品的特性進(jìn)一步純化分離。培養(yǎng)初期可能有少數(shù)造血細(xì)胞貼壁，但隨著換液及傳代，最后只留下能貼壁的成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞，這即為最終獲得的MSCs。

3.2 MSCs的細(xì)胞表面分子標(biāo)記 目前尚無(wú)MSCs的特異性標(biāo)志，對(duì)MSCs的特征描述及其分離方法都是以一個(gè)細(xì)胞群體的形式進(jìn)行的，可表達(dá)多種表面標(biāo)記物，CD44是MSCs的重要標(biāo)志物，而MSCs不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P3代MSCs不表達(dá)抗原CD34，表達(dá)抗原CD44，符合MSCs的表面標(biāo)志物特征。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心法從骨髓中離心出單個(gè)核細(xì)胞層，結(jié)合貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體外增殖能力較強(qiáng)。通過(guò)鑒定細(xì)胞表面抗原標(biāo)志，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)研究中所分離培養(yǎng)細(xì)胞是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)所采用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便、快捷、可靠，可用于后期實(shí)驗(yàn)研究。

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