汪正芳，郭前坤，張聲生

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院消化中心，北京 100010）

腸易激綜合征（IBS）是腸道動力學(xué)和內(nèi)臟感覺異常的胃腸道功能性疾病，是一組以排便習(xí)慣改變（腹瀉、便秘）、糞便性狀異常（稀便、黏液便）、腹脹及腹痛等為臨床表現(xiàn)的綜合征，癥狀可持續(xù)存在或間歇發(fā)作[1]。臨床上以腹瀉型為多見[2-3]。IBS病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前治療缺乏確切而有效的辦法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腹瀉型腸易激綜合征與肝郁、脾虛密切相關(guān)[4]。筆者采用具有調(diào)肝理脾、燥濕止瀉作用的疏肝健脾方治療腹瀉型腸易激綜合征（D-IBS）在臨床已經(jīng)取得了很好的療效。本實驗以血漿中的 5-羥色胺（5-HT）、P物質(zhì)（SP）及血管活性腸肽（VIP）和結(jié)腸組織中SP及VIP為主要測定指標(biāo)，以得舒特為陽性對照藥，觀察疏肝健脾方對D-IBS模型大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，北京維通利華實驗動物公司提供，合格證號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥品與試劑 冰醋酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號：20110517）。得舒特（匹維溴安），法國蘇威制藥（批號：621959）。5-HT、SP及VIP試劑盒由北京華英生物技術(shù)有限公司提供。

疏肝健脾方：由黨參、白術(shù)、八月札、白芍、陳皮等藥物組成，均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備，按一定比例制成生藥濃度分別為1.7、3.4、6.8 g/mL 備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組為正常組、模型組、得舒特組，以及中藥低、中、高劑量組，每組10只。正常組：正常喂食，自由飲水，不予任何處理；模型組，得舒特組及中藥低、中、高劑量組以乙酸灌腸加束縛應(yīng)激的方法建立D-IBS大鼠模型。

1.3.2 造模方法 實驗前18 h禁食、不禁水，乙醚麻醉后經(jīng)肛門插入連接注射器的硅膠管（距肛門8 cm），結(jié)腸內(nèi)灌入40 mL/L的乙酸1 mL，緩慢拔出硅膠管，用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30秒，后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）1 mL沖洗結(jié)腸[5]，放回籠中自由活動進(jìn)食水，于第7天行束縛應(yīng)激，每天用寬透明膠帶束縛前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部[6]，束縛時間2 h，連續(xù)束縛7 d。

1.3.3 動物給藥方法 各組造模結(jié)束后第2天開始進(jìn)行藥物干預(yù)。得舒特組按照實驗動物研究“等效劑量”的計算方法，給予15 mg/（kg·d）灌胃給藥；中藥低、中、高劑量組（按60 kg成人體表面積換算，低、中、高劑量組分別為標(biāo)準(zhǔn)劑量組、2倍劑量組及4倍劑量組）分別給予17、34、68 g/（kg·d）；正常組和模型組每天灌服等容量生理鹽水，連續(xù)治療14 d。給藥體積10 mL/（kg·d）。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 觀察大鼠的一般情況，檢測大鼠糞便的含水量及腹壁撤退反射（AWR）評分，血漿及結(jié)腸組織中5-HT、SP及VIP含量。

1.4.1 糞便含水量 在大鼠造模完成后及治療結(jié)束后分別稱量各組大鼠糞便的濕質(zhì)量及干質(zhì)量，糞便含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.4.2 AWR評分 大鼠實驗前18 h禁食不禁水，在乙醚麻醉下，將涂石蠟油帶氣囊的8F導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入（氣囊末端距肛門1 cm，在肛門外1 cm處將其固定在大鼠尾根部），將大鼠放入特制的透明塑料桶籠內(nèi)（20 cm×8 cm×8 cm）中，只能前后運(yùn)動不能轉(zhuǎn)身，待大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min后開始實驗。每只大鼠給予球囊擴(kuò)張4次，容量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mL，每次擴(kuò)張持續(xù)5 min，間隔30秒（防止出現(xiàn)腸道缺血壞死）。

AWR評分標(biāo)準(zhǔn)[7]：0分，結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時大鼠情緒基本穩(wěn)定；1分，給予刺激時開始出現(xiàn)不穩(wěn)定，偶有扭動頭部；2分，刺激時腹背部肌肉輕微收縮但腹部不抬離地面；3分，給予刺激時腹背部肌肉較強(qiáng)烈收縮并有腹部抬離地面情況；4分，刺激時腹部肌肉強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形，腹部﹑會陰部抬離地面。

1.4.3 血漿及結(jié)腸組織標(biāo)本采集

1.4.3.1 血漿標(biāo)本制備 以10%水合氯醛（3 mL/kg腹腔注射），麻醉下，腹主靜脈取血3 mL，注入含有10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）30 μL 和抑肽酶1000 KIU試管中混勻，低溫離心15 min，轉(zhuǎn)速2000 r/min，分離血漿，分裝置于-20℃冰箱保存待測。測定前將樣本置于自來水浴中復(fù)融，再次低溫離心（1500r/min，15min），取上清進(jìn)行放射免疫實驗。

1.4.3.2 結(jié)腸組織標(biāo)本制備 禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，剖開腹腔，取出結(jié)腸并剪下（距離肛門8 cm以內(nèi)），沿著腸系膜縱向剪開，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗，濾紙拭干，-80℃冰箱凍存。測前取出組織稱質(zhì)量后于生理鹽水（1 mL）中煮沸3 min，冷卻后加入1mol/L冰醋酸0.5mL于勻漿器中勻漿，再用1 mol/L NaOH中和，低溫離心20 min，3000 r/min。取上清液儲存于-20℃以下待測。

1.5 統(tǒng)計方法 用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，所有實驗計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用軼和檢驗，以P<0.05為差異且有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況及一般情況觀察 在實驗過程中，共死亡5只大鼠，其中中藥高劑量組2只，中劑量組1只，得舒特組2只，其余各組大鼠情況良好。筆者在使用乙酸灌腸加束縛應(yīng)激造模過程中發(fā)現(xiàn)大鼠性情明顯改變，急躁易怒，觸碰不得；毛發(fā)晦暗無光澤，食欲下降，排稀便明顯，與D-IBS的臨床表現(xiàn)相近。上訴表現(xiàn)經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組均較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 疏肝健脾方對大鼠糞便含水量的影響 疏肝健脾方能明顯改善D-IBS大鼠糞便的含水量，促進(jìn)腸道對水分的重吸收增加，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。高劑量疏肝健脾方要優(yōu)于匹維溴銨（P＜0.05）。見表1。

表1 治療前后糞便含水量的比較（±s）Tab.1 Comparison of defecation moisture before and after treatmen（±s）%

表1 治療前后糞便含水量的比較（±s）Tab.1 Comparison of defecation moisture before and after treatmen（±s）%

注：與模型組比較，*P<0.01，與得舒特組比較，#P<0.05。

組別 給藥后正常組 20.45±1.65*模型組 45.20±1.28得舒特組 25.41±2.08*疏肝健脾低劑量組 30.33±3.41*疏肝健脾中劑量組 25.26±2.22*疏肝健脾高劑量組 20.17±2.86*#n 101081098給藥前20.35±2.50*45.89±2.3745.07±2.4445.50±2.4644.90±2.6244.93±2.41

2.3 AWR的影響 在不同的擴(kuò)張容量下，模型組大鼠AWR評分較其余各組明顯增加，說明模型組大鼠內(nèi)臟敏感性增加，中藥低劑量組雖也有改善，但在不同擴(kuò)張容量下不一致，說明疏肝健脾方劑量太少時也達(dá)不到很好的改善內(nèi)臟敏感性的作用。見表2。

表2 給藥后AWR比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR after treatmen（±s）分

表2 給藥后AWR比較（±s）Tab.2 Comparison of AWR after treatmen（±s）分

注：與模型組比較，*P<0.01，#P<0.05。

組別 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL正常組 0.90±0.42*1.97±0.19*2.67±0.31*模型組 1.50±0.362.63±0.253.73±0.26得舒特組 0.97±0.25*2.03±0.19*2.73±0.31*疏肝健脾低劑量組 1.30±0.292.43±0.16#3.60±0.21疏肝健脾中劑量組 1.03±0.29*2.10±0.16*2.77±0.32*疏肝健脾高劑量組 0.93±0.21*2.07±0.14*2.63±0.29*n 1010810980.5 mL 0.07±0.14*1.13±0.230.17±0.24*0.57±0.23*0.37±0.25*0.20±0.23*

2.4 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿5-HT的影響疏肝健脾方中、高劑量組血漿5-HT含量明顯低于D-IBS大鼠（P<0.05），疏肝健脾方低劑量組雖然與模型組也有區(qū)別，但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組血漿中5-HT含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in blood plasma of each group（±s）μg/L

表3 各組血漿中5-HT含量的比較（±s）Tab.3 Comparison of 5-HT content in blood plasma of each group（±s）μg/L

注：與模型組比較，*P<0.01，#P<0.05。

組別 n 血漿5-HT含量正常組 10148.280±35.283#模型組 10195.545±25.383得舒特組 8151.594±39.852#疏肝健脾低劑量組 10188.850±17.628疏肝健脾中劑量組 9162.881±17.498#疏肝健脾高劑量組 8139.796±30.826*

2.5 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿及結(jié)腸組織SP的影響 疏肝健脾方各劑量組血漿中SP含量較D-IBS大鼠低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；疏肝健脾方可以改善D-IBS大鼠結(jié)腸組織中SP水平（P<0.05）。見表4。

表4 各組血漿及結(jié)腸組織中SP含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of P content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

表4 各組血漿及結(jié)腸組織中SP含量的比較（±s）Tab.4 Comparison of P content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：與模型組比較*P<0.01，#P<0.05。

組別 n 血漿SP含量 結(jié)腸組織SP含量正常組 1060.767±8.8247.743±1.907模型組 1066.174±6.1058.918±1.356得舒特組 860.821±5.1748.149±1.028疏肝健脾低劑量組 1052.651±9.0717.538±1.070*疏肝健脾中劑量組 963.942±7.3207.155±0.713*疏肝健脾高劑量組 864.091±3.4227.424±1.378#

2.6 疏肝健脾方對D-IBS大鼠血漿及結(jié)腸組織VIP的影響 疏肝健脾各劑量組血漿及結(jié)腸組織中VIP含量均較D-IBS模型組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

D-IBS臨床上主要以腹瀉、腹痛或腹部不適為主癥，其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理生理學(xué)變化主要包括胃腸道動力紊亂及內(nèi)臟感覺敏感度異常等，目前認(rèn)為與精神因素，胃腸激素變化，炎癥介質(zhì)及免疫因素等有關(guān)[8]。腦腸肽是調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動的重要物質(zhì)，與IBS發(fā)病密切相關(guān)，常見有5-HT、VIP、SP、神經(jīng)肽-Y（NPY）等[9]。中醫(yī)學(xué)根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將 D-IBS 歸屬于“泄瀉”、“腹痛”、“腸郁”等范疇，主要病機(jī)是肝郁脾虛、肝脾不和、脾虛濕盛。疏肝健脾方是多年臨床實踐和研究得出的治療D-IBS的經(jīng)驗方，主要是由黨參、白術(shù)、八月札、白芍、陳皮等藥物組成。方中以黨參、白術(shù)、白芍為君藥奏調(diào)肝理脾之功；臣以八月札、陳皮等以健脾理氣燥濕；諸藥合用，調(diào)肝、理脾、燥濕、止瀉，諸功兼?zhèn)?，?biāo)本兼治。筆者采用乙酸灌腸加束縛應(yīng)激的方法制備D-IBS動物模型以腹瀉為主要癥狀，伴有煩躁、抑郁等變化，與D-IBS臨床癥狀相似，使用該模型來探討疏肝健脾方治療D-IBS的作用機(jī)制。

表5 各組血漿及結(jié)腸組織中VIP含量的比較（±s）Tab.5 Comparison of VIP content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

表5 各組血漿及結(jié)腸組織中VIP含量的比較（±s）Tab.5 Comparison of VIP content in blood plasma and colon of each group（±s）ng/L

注：與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 血漿VIP含量 結(jié)腸組織VIP含量正常組 1025.738±3.403* 4.290±0.940*模型組 1029.871±3.7785.554±1.195得舒特組 827.063±4.6024.782±0.937疏肝健脾低劑量組 1028.049±5.0274.909±0.340疏肝健脾中劑量組 927.936±3.9804.616±0.658疏肝健脾高劑量組 827.298±5.4064.555±0.809

5-HT作為一種腦腸肽，近年來被認(rèn)為是參與IBS發(fā)病的胃腸激素之一，是目前研究的熱點(diǎn)問題。Wade[10]和Kyosola[11]研究表明IBS患者血漿5-HT含量升高；張川等[12]的研究也表明D-IBS患者血清中5-HT濃度增高；5-HT的異常升高是導(dǎo)致腸道動力異常和內(nèi)臟感覺過敏，也是引起腹瀉的重要物質(zhì)[13]。本實驗研究結(jié)果提示，本方能調(diào)節(jié)D-IBS大鼠血漿5-HT的異常變化，這可能是其改善D-IBS臨床癥狀的作用機(jī)制之一。而低劑量組雖也有降低，但差異不顯著，說明中藥對IBS的治療作用和劑量大小也有關(guān)系，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在劑量過小時治療效果不甚明顯。

SP是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，對SP與IBS的關(guān)系的研究，國內(nèi)外尚無一致結(jié)論。張紅杰等[14]的研究表明腸易激綜合征的患者血漿中SP無顯著的變化。李兆申等[15]的研究表明腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜SP含量顯著高于正常對照組，并推測D-IBS腸黏膜SP含量升高可能與D-IBS患者結(jié)腸高動力，黏液分泌增多致腹瀉有關(guān)。本實驗研究結(jié)果也表明，血漿中SP的含量與腸易激綜合征之間無顯著性聯(lián)系。而大鼠結(jié)腸組織中SP含量中藥高、中劑量組明顯低于模型組，與目前的研究結(jié)果一致，提示疏肝健脾方可能是通過改變SP的異常分泌以改善胃腸道的分泌和運(yùn)動功能，達(dá)到治療效果。

VIP是從豬小腸提取物中分離出的一種有明顯擴(kuò)張血管降低血壓的物質(zhì)，Morise K等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，VIP與IBS患者的腹瀉和腹痛等癥狀相關(guān)。李兆申等[15]的研究也表明D-IBS的患者血漿中血管活性腸肽的水平較正常人明顯升高。筆者的實驗結(jié)果提示，疏肝健脾方改善D-IBS的臨床癥狀與抑制VIP的異常升高關(guān)系不是很密切。

綜上所述，本實驗以乙酸灌腸加束縛應(yīng)激的方法建立的大鼠D-IBS模型在一定程度上模擬了人的D-IBS臨床表現(xiàn)，在使用經(jīng)驗方疏肝健脾方干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)疏肝健脾方可以有效緩解D-IBS大鼠腹瀉及內(nèi)臟高敏性，其作用可能是通過降低5-HT及SP而實現(xiàn)的，但是由于中藥復(fù)方的成分不是十分肯定，起效物質(zhì)也不是很明確，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，但是調(diào)節(jié)胃腸激素很可能是疏肝健脾方發(fā)揮治療作用的一個很重要的因素。

[1]林 剛.洪善的治療腹瀉型腸易激綜合征經(jīng)驗擷英[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（3）：185-186.

[2]熊理守，陳吳湖，陳惠新，等.廣東省社區(qū)人群腸易激綜合征的流行病學(xué)研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2004，84（4）：278－281.

[3]潘國宗，魯素彩，柯美云，等.北京地區(qū)腸易激綜合征的流行病學(xué)研究：一個整群、分層、隨機(jī)的調(diào)查[J].中華流行病學(xué)雜志，2000，21（1）：26－28.

[4]吳 兵，張聲生.腸易激綜合征腹瀉型的證候?qū)W研究進(jìn)展[J].北京中醫(yī)藥，2007，26（5）：312－314.

[5]La JH,Kim TW,Sung TS,et al.Visceral hypersensitivity and altered colonic motility after subsidence of inflammation in a rat model of colitis[J].World J Gastroenterol,2003,9(12):2791-2795.

[6]Williams CL,Villar RG,Peterson JM,et al.Stress-induced changes in intesti-nal transit in the rat:a model for irritable bowel syndrome[J].Gastroenterology,1988,94(3):611-621.

[7]Ness TJ,Gebhart GF.Colorectal distension as a noxious visceral stimulus:physiol-ogicandpharmacologiccharacterization of pseudaffective reflexes in the rat[J].Brain Res,1988,450(1-2):153-169.

[8]楊 紅，錢家鳴.胃腸激素與腸易激綜合征[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2002，11（4）：367－369.

[9]馬 薇，龍霖梓，彭芝配，等.九香止瀉片對腹瀉型腸易激綜合征大鼠血漿VIP、NPY和腸黏膜5-HT的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，29（6）：29－32.

[10]Wade PR,Chen J,Jaffe B,et al.Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract[J].J Neurosci,1996,16(7):2352.

[11]Kyosola K,Penttila O,Salaspuro M.Rectal mucosal adrenergic innervation and enterochromaffin cells in ulcerative colitis and irritable colon[J].Scand J Gastroent,1977,12(3):363.

[12]張 川，李定國，王彝康，等.腸易激綜合征患者5-羥色胺含量的變化[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，21（1）：66－68.

[13]Sanger GJ.5-HT and functional bowel disorders[J].Neurogastroenteml Motil,1996,8(4):319.

[14]張紅杰，林 琳，趙志泉，等.胃腸肽類激素與腸易激綜合征發(fā)病間的關(guān)系[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，24（2）：147－151.

[15]李兆申，董文珠，鄒多武，等.腸易激綜合征腸黏膜SP、VIP、CGRP變化的研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，24（2）：147-151.

[16]Morise K,Furusawa A,Yamamoto H.Role of gut hormones in irritable bowel syndrome[J].Nippon Rinsho,1992,50(11):2697-2702.