羅建勛，董 昕，辜云杰

(1.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081;2.四川農(nóng)業(yè)大學林學院，四川雅安 625014)

云杉屬(Picea Dietr.)植物歷史悠久，全世界約有40種［1］。據(jù)古氣候學和古環(huán)境學研究證實，云杉屬植物早在白堊紀就在地球上有分布，后經(jīng)地質變遷，形成了現(xiàn)今的分布格局，即主要分布在北緯50°～60°的寒溫帶或凍原地帶，少數(shù)分布在溫帶和亞熱帶的濕冷亞高山帶上。云杉屬植物因其樹干通直圓滿，材質好，出材率高，而且適生性強，現(xiàn)已成為西歐、北歐、波羅的海沿岸國家、俄羅斯和加拿大的重要造林樹種與工業(yè)用材林樹種。同時，云杉屬樹種高度異交，雜合度較高，其天然群體具有豐富的遺傳多樣性，所以是研究遺傳變異的好材料，通過發(fā)掘變異和利用遺傳變異，達到林木遺傳改良和種質資源保存的目的。迄今為止，對云杉屬遺傳變異的研究先后經(jīng)歷了形態(tài)學標記、細胞學標記、同工酶標記和DNA標記4個階段，目前以DNA分子水平的研究為熱點。DNA標記技術起源于20世紀70年代的西歐，而后迅速發(fā)展，被各地廣泛應用，尤其是21世紀頭10a，該項技術更加推動了國外云杉屬植物遺傳多樣性研究在分子水平上的發(fā)展，并取得了卓有成效的成果。然而，我國云杉資源豐富，但DNA分子標記方面的研究起步較晚，有待進一步發(fā)展。就論文發(fā)表情況而言，僅在1990年～2000年間，曾見羅建勛［2］、張含國［3］、王芋華［4］等少數(shù)幾個人對國外云杉遺傳多樣性進行過詳細論述。綜上，有必要對2000年～2010年國外云杉屬植物天然群體的DNA標記進行綜述。

1 DNA標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

DNA分子標記技術已經(jīng)在云杉屬樹種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、種的鑒定與親緣關系分析和基因表達分析等方面得到了廣泛的應用，尤其是在遺傳多樣性與遺傳分化分子水平的研究必不可少，已經(jīng)從核DNA研究擴展到覆蓋線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體 DNA(cpDNA)的研究。例如Maghuly等［5］開發(fā)了挪威云杉(Picea abies)群體的線粒體遺傳標記。眾所周知，種群是物種進化的基本單位，群體在自然界中有其特定的分布格局式樣，所以研究遺傳多樣性不僅要分析遺傳變異的高低，還要了解遺傳變異在群體內和群體間的分布式樣以及在時間上的變化，即遺傳結構。然而，云杉屬樹種的基因組較大，2C=29 ×109bp［6］，且 70%是非編碼區(qū)，基因的表達尚不清楚，對基因組的量化描述也存在局限性，因此，利用DNA標記對云杉屬的變異進行定量分析，可以追尋其進化規(guī)律的蹤跡，從而能更好地利用現(xiàn)存云杉遺傳材料。根據(jù)各種標記的開發(fā)基礎，主要將其分為4類。

1.1 基于DNA-DNA雜交的分子標記與云杉天然群體的遺傳研究

1.1.1 RFLP標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態(tài)性)是第一個被應用于遺傳研究的 DNA分子標記，1974年由 Grozdicker創(chuàng)立。RFLP是一種共顯性遺傳標記，首先利用限制性內切酶將基因組DNA消化成不同分子量的同源片段，而后經(jīng)電泳分離再轉移到濾膜上，然后進行southern雜交，最后通過放射性自顯影或酶學檢測技術檢測限制性酶切片段多態(tài)性。Dering和Lewandowski［7］為了確定冰河后期挪威云杉從避難所遷出形成的接合區(qū)域，利用PCR-RFLP標記分析了58個挪威云杉群體1 353個個體的線粒體基因nad1 b/c多態(tài)性，檢測到波蘭境內的挪威云杉有兩種DNA變異型，即“南部單體型”和“北部單體型”。研究發(fā)現(xiàn)這些單體型的地理分布與特有的挪威云杉分布范圍和避難所起源相符?！氨狈叫汀敝饕植荚谂餐粕挤植紖^(qū)的北部，“南方型”主要分布在挪威云杉分布區(qū)的南部。兩種單體型同時出現(xiàn)在無云杉區(qū)域(根據(jù)花粉數(shù)據(jù)推測，在挪威云杉天然分布區(qū)內以中歐為界分成南北兩個區(qū)域，在中歐的斷裂處形成南部與北部的重疊分布區(qū)，也叫無云杉區(qū))，無云杉區(qū)域內，以標記為“南方單體型”的群體出現(xiàn)的頻率較高。結合化石和花粉數(shù)據(jù)認為，波蘭中部平原的挪威云杉群體分別從阿爾巴千山和俄羅斯遷移至此，而后交匯形成。起源于阿爾巴千山的云杉在重疊區(qū)域分布居多，可能是因為該起源比俄羅斯起源遷移得更早。

1.1.2 VNTR標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

VNTR(variable number of tandem repeats，數(shù)目可變串聯(lián)重復序列)也叫小衛(wèi)星標記，是共顯性遺傳標記，由幾個到幾十個核苷酸序列重復構成，拷貝數(shù)為幾十到幾百不等。VNTR的原理與AFLP的基本相同，但要求VNTR的酶切位點在重復序列之外，且內切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點，同時還需滿足雜交DNA探針序列與微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列相同。盡管小衛(wèi)星標記的多態(tài)信息量較高，但其在基因組中分布不均勻，因此，不如其他標記應用范圍廣，在云杉群體多樣性研究中也僅有少量的報道。Bastien等［8］以自然分布區(qū)內的14個挪威云杉群體92個個體為材料，檢測其mtDNA多態(tài)性，共獲得11條長度為131-447bp的多態(tài)性序列，這些序列由3個串聯(lián)基序以不同拷貝數(shù)重復形成。串聯(lián)重復數(shù)的差異反映出群體間基因多態(tài)性很高，群體間分化很大，遺傳分化系數(shù)Gst=0.749。

1.2 基于PCR技術的分子標記與云杉天然群體的遺傳研究

1.2.1 RAPD標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)是由Williams于1990年發(fā)明的一種檢測核苷酸序列多態(tài)性的方法。RAPD通常用1個8 bp～10 bp隨機引物非定點地擴增基因組DNA，然后利用PCR技術從擴增的DNA片段上分析多態(tài)性，即反映出不同遺傳材料的多態(tài)性。因這種標記技術要求低，對于生物學資料未知的基因組就可檢測到大量多樣性信息，加之成本低，所以幾乎用于云杉屬的各種遺傳分析。Collignon等［9］在挪威云杉的整個自然分布區(qū)內對其進行RAPD和數(shù)量性狀的地理變異分析。據(jù)此，挪威云杉被劃分成北歐和中歐兩個地理上的類群，每個類群內的數(shù)量性狀和DNA之間存在著明顯的解偶聯(lián)。然而，將分子方面和數(shù)量性狀方面提供的信息結合起來能夠為地理變異模式提供新的深入了解:發(fā)現(xiàn)在Baltico-Nordic區(qū)域是以緯度梯度為主導的地理變異模式，這與通過花粉數(shù)據(jù)推斷的云杉以東-西方向遷移為主導的地理變異模式明顯相悖;然而，在中歐地區(qū)，云杉以經(jīng)度梯度為主導的遷移與花粉報告的結果一致。該研究對于通過數(shù)量性狀和DNA得到的一致和矛盾的結果，以挪威云杉發(fā)生歷史性事件的形式對其進行了討論。Jeandroz等［10］以法國境內8個挪威云杉群體(6個天然群體，1個種子園群體，1個栽植群體)為材料應用RAPD和mtDNA標記對挪威云杉，進行了群體間的變異研究。研究通過RAPD表型分析確定了法國境內歐洲云杉遺傳資源的3個群體，它們分別是孚日山脈(天然源群體和栽植群體)群體、北阿爾卑斯山群體或侏羅紀山脈群體以及南阿爾卑斯山群體。境內群體的基因多樣性值差異不大。線粒體標記的研究結果顯示，在DNA MH44位點處存在一個重要變異，6個孚日山脈的天然參試群體表現(xiàn)出阿爾卑斯山脈群體特有的特征。孚日山脈的栽植群體表現(xiàn)出兩個額外的mtDNA類型，這支持了19世紀后期法國境內的歐洲云杉是從歐洲東部遷移而來的假說。

1.2.2 SCAR標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

SCAR(sequence-characterized amplified region，序列特征化擴增區(qū)域)是將所找到的RAPD標記進行克隆并分析，根據(jù)RAPD兩側序列設計特異引物，再對基因組DNA進行PCR擴增而產(chǎn)生的分子標記。SCAR常以擴增產(chǎn)物的有無反映被檢DNA的差異性，此時為顯性標記;有時也表現(xiàn)為擴增片段長度的多態(tài)性，此時為共顯性標記。Scotti等［11］在研究挪威云杉上一次冰期后再侵入阿爾卑斯山的遷移路線時，曾對沿阿爾卑斯山脈的7個群體和一個亞平寧山脈群體的7個SCAR位點進行特征分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內挪威云杉的遺傳變異分布不均勻，群體間遺傳分化程度較高，遺傳分化系數(shù)Fst=0.118。根據(jù)分子方差分析和距離分離模型檢驗結果，在亞平寧山脈存在冰期種源區(qū)的假說不成立，認為亞平寧山脈群體在地理上處于冰期后再次侵入群體分布區(qū)的邊緣，是由迪納拉山脈群體從東北向西南遷移至此形成的，而鄰海的阿爾卑斯山脈則可能有殘余群體，其挪威云杉群體被南北方向的分界線劃分成兩部分。盡管SCAR標記在云杉群體遺傳多樣性研究中的應用不如RAPD標記廣泛，但其能夠彌補RAPD產(chǎn)生假帶、不穩(wěn)定的不足，在云杉屬樹種的親緣關系分析中發(fā)揮了一定作用。

1.2.3 AFLP標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)是RAPD標記和RFLP標記的組合，根據(jù)限制性內切酶酶切片段的不同長度檢測基因多態(tài)性，同時兼有RAPD標記的簡便性和RFLP標記的可靠性，被認為是一種先進的DNA分子標記，即第二代分子標記。AFLP標記被廣泛用于云杉屬樹種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建和基因定位等。XR Wang等［12］以瑞典北部7個島(有的島發(fā)生過林火，且島的面積不同)上的挪威云杉群體共117個個體進行群體結構的研究，利用105個AFLP多態(tài)性標記對材料分析，獲得96個特異的基因型，平均基因多樣性P為0.37，群體間遺傳變異高，群體間遺傳分化系數(shù)Fst=0.19。研究認為遺傳漂變、奠基者效應、群體小、低頻率的有性生殖以及產(chǎn)種量少是導致群體間遺傳變異高的原因。

1.2.4 SSR標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

SSR(Simple Sequence Repeat，簡單序列重復)標記又叫微衛(wèi)星DNA，通常由1～6個核苷酸組成的核心序列串聯(lián)重復而成，長度通常不超過200bp，因其兩側序列為相對保守的單拷貝序列，可根據(jù)兩側序列設計特異引物，經(jīng)PCR擴增獲得SSR的核心序列，由于核心序列的串聯(lián)重復數(shù)不同，所以PCR產(chǎn)物長度不同，進而揭示SSR的多態(tài)性。SSR因具有共顯性、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，所以是群體遺傳結構和多樣性研究、遺傳圖譜構建等的理想工具。Hodgetts等［13］開發(fā)了白云杉(Picea glauca)的 SSR標記，利用13對引物擴增加拿大西部3個地區(qū)的白云杉材料，獲得14個多態(tài)性位點，每位點等位基因數(shù)為3～32不等，觀測雜合度Ho為0.33～0.94不等，說明白云杉SSR標記具有很高的遺傳多態(tài)性。用相同的引物去擴增黑云杉(P.mariana)、紅云杉(P.rubens)、挪威云杉(P.abies)、科羅拉多云杉(P.pungens)、北美云杉(P.sitchensis)和恩氏云杉(P.engelmannii)，大多數(shù)都能擴增出多態(tài)性位點，且多態(tài)性較高;用這些引物去擴增非云杉屬的針葉樹種，發(fā)現(xiàn)并不是所有的都能得到多態(tài)性產(chǎn)物，說明這些標記可能僅限于云杉屬樹種擁有。A’Hara和Cottrell［14］以一些無親緣關系的北美云杉(Picea sitchensis)和其全同胞家系子代為材料，進行基因組微衛(wèi)星分析得到觀測雜合度Ho為0.38～0.91，每位點等位基因數(shù)A為6～21，平均每位點等位基因數(shù)為12.2，并得出其全同胞家系子代多態(tài)性位點分離比遵守孟德爾遺傳規(guī)律的結論。Scotti等［15］為了粗略獲得挪威云杉染色體組結構圖譜，以瑞典4個不同區(qū)域25年生的85個雜交子代個體為材料，利用6種(AFLP，SSR，S-SAPs，IRAP，ESTP 和 inter-LTR)不同的分子標記建立了模擬測交遺傳連鎖圖譜。該研究利用3種以上的標記分別獲得了27個母本圖譜的連鎖群和23個父本圖譜的連鎖群，根據(jù)不同標記在兩個圖譜上的分布特點將二者整合，得到具有13個連鎖群的雙親圖譜，再以此圖譜檢測每種標記在染色體中出現(xiàn)的頻率，并利用自相關分析找到彼此關聯(lián)的標記，確定他們在染色體上的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)不同序列單元在基因組中分布不均勻，有些標記聚集分布，而有些有關聯(lián)的序列卻隨機分布，研究還發(fā)現(xiàn)并不是所有的標記都在染色體上具有等量的連鎖群，說明挪威云杉染色體空間結構不是均質的。Bastien［8］應用微衛(wèi)星標記對長為11bp的變異序列進行了系統(tǒng)發(fā)生分析，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹很好地展示了群體間親緣演化關系。Nasri等［16］利用父系遺傳的葉綠體微衛(wèi)星研究地理上嚴格受限的塞爾維亞云杉地方樹種P.omorika的群體遺傳結構。利用7個天然群體，每群體14個個體擴增出9個cpSSR片段，其中包括5個多態(tài)性區(qū)域，獲得4個不同的單體型。平均總單體型多樣性HT=0.395，平均群體內多樣性HS=0.279，其單體型變異是目前描述過的大多數(shù)針葉樹中較低的，并依據(jù)單體型變異將其劃分為南部和北部2個地理群體。北部群體僅有一種單體型，而南部群體表現(xiàn)為2種～3種單體型。研究認為當前形成的P.omorika群體遺傳結構是由第四紀冰期的瓶頸作用和遺傳漂變刻畫的。因此，認為P.omorika是遺傳衰退樹種中的一個小群體。Ballian等［17］以巴爾干半島的13個群體(其中2個群體與Nasri選用的一樣)為材料進行研究，結果表明:盡管群體間遺傳分化明顯，遺傳分化系數(shù)Fst=0.261，但未檢測到遺傳變異的地理分化。群體結構的貝葉斯分析結果顯示，當前的塞爾維亞云杉是其祖先P.omoricoides遺留下的一個分支。Anderson等［18］對橫貫北美東北部的24個白云杉群體的cpDNA進行測序，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)單體型是特異的，在阿拉斯加區(qū)域的單體型多樣性相當高，顯然白云杉很久以前就在具有極端氣候冰河期的異質生境中存在，這一結果反駁了白云杉在冰河后期由南部的勞倫太德冰蓋向北部遷移的結論。這些結果都表明，從化石記錄中推測的遷移速率太高，白云杉適應氣候變化的能力不如之前想象的那樣強。Aizawa等［19］以魚鱗云杉(Picea jezoensis)mtDNA 和 cpDNA為材料，對日、俄、中、韓共33個天然群體的遺傳結構進行分析，描繪了魚鱗云杉在日本周圍海峽交匯處的線粒體單體型地理分布模式(群體間遺傳分化系數(shù)GST=0.901;基因流NST=0.934)。然而，以前的魚鱗云杉群體葉綠體單體型分布模式資料顯示日本周邊海峽處花粉流數(shù)據(jù)與此差異很大(GST=0.233;NST=0.333)。物種的地理隔離成為種子和花粉遷移的障礙，隔離的群體分別獨立進化，在群體交匯處則表現(xiàn)出明顯的遺傳分化。因為勘察加半島(位于蘇聯(lián)北部)群體不相連接，所以推測勘察加半島是魚鱗云杉當前分布的北緣。研究發(fā)現(xiàn)，在日本境內的北海道島和本州島之間存在魚鱗云杉的地理變異型。就此討論了東北亞云杉的演化歷史，認為本州島的群體可能是從亞洲大陸經(jīng)朝鮮半島遷移過去，北海道群體可能從亞洲大陸經(jīng)庫頁島遷移過去。日本境內兩島上的群體具有特有線粒體單體型，可能是因第四紀冰河后期兩島與亞洲大陸在地理上的隔離所致。

1.2.5 ISSR標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

ISSR(Inter-simple Sequence Repeat，簡單序列重復區(qū)間)標記由Zietkiewicz等［20］于1994年開發(fā)，是一種用于檢測SSR區(qū)間序列差異的分子標記技術。與SSR標記相比，ISSR標記不需要已知微衛(wèi)星兩側序列去設計引物，就可擴增出目的片段，穩(wěn)定性好，且能比RFLP、RAPD和SSR標記反映出更多的多態(tài)性信息，在云杉屬群體遺傳多樣性分析中應用得較好。Sylwia Dobrzeniecka等［21］利用 ISSR 標記對不同重金屬污染程度的高地和洼地上黑云杉群體進行遺傳分析。多態(tài)位點百分率P為65%～90%不等，平均多態(tài)位點百分率為75%;平均每位點等位基因觀測數(shù)Na為1.650～1.900，平均有效等位基因數(shù)Ne為1.168～1.632;群體內遺傳多樣性h為0.264～0.359不等，平均群體內遺傳多樣性為0.310;香濃多樣性指數(shù)I為0.381～0.524，平均值為0.449;群體遺傳距離為0.171～0.351。研究表明，黑云杉群體具有較高的總遺傳變異，但群體間的遺傳變異很低，該研究認為群體內的遺傳變異很高。該結論與 Perry和 Bousquet［22］的研究相符。而 Rajora和Pluhar［23］在馬尼托巴省的的東部和北部區(qū)域同樣對黑云杉天然群體的多樣性進行分析，并沒有發(fā)現(xiàn)群體間存在顯著變異，就此認為黑云杉群體間的遺傳多樣性不受地理因素的影響。ISSR可與其他標記聯(lián)合用于云杉屬樹種的鑒定。K.K.Nkongolo等［9，10］應用 RAPD、ISSR 分子標記鑒定了紅云杉、白云杉、黑云杉和恩氏云杉。該研究用ISSR的827號引物分別擴增出450 bp的恩氏云杉特異性片段和770 bp的白云杉特異性片段;用ISSR的841號引物分別擴增出230 bp的白云杉特異性片段和470 bp的黑云杉特異性片段;同樣根據(jù)RAPD標記獲得的紅云杉和黑云杉特異性片段將4種云杉鑒別出來。幼齡時期的黑云杉在形態(tài)上與白云杉和紅云杉相似，利用分子標記分析可將黑云杉從紅云杉和白云杉中鑒別出來。研究采用ISSR標記和SCAR標記進行分析，認為ISSR分析中270 bp片段是白云杉的特征性標記，470bp片段為黑云杉的特征性標記，SCAR分析中792 bp片段為紅云杉的特征性標記，從而，根據(jù) ISSR和 SCAR分析將黑云杉篩選出來［21］。

1.3 基于mRNA的分子標記與云杉天然群體的遺傳研究

1.3.1 EST標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

EST(Expressed sequence tags，表達序列標簽)是長為150 bp～500 bp的基因表達序列片段。EST標記是將mRNA反轉錄成cDNA并克隆到載體構建成cDNA文庫，再大規(guī)模隨機挑選cDNA克隆，對其5'端或3'端進行一步法測序，將所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫已知序列比較，從而獲知生物體生長發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過程。EST被看作是獲得重要基因序列的快捷途徑，近年來，開發(fā)出一系列適用于植物研究的EST標記，如ESTSSR、EST-RFLP、EST-AFLP和 EST-SNP等。這些標記在云杉屬植物的遺傳研究中得到了高效的應用。EST-SSR分子標記是基于表達序列標簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標記。由于云杉的基因組比較大，重復的DNA序列較多，經(jīng)常產(chǎn)生復雜的多位點擴增產(chǎn)物，使 SSR標記在云杉的應用中受到限制，而EST-SSRs標記在這一點比SSR標記具有優(yōu)越性。EST-SSR與基因組SSR相比，具有可在植物物種之間轉移的優(yōu)點。目前，EST-SSR被廣泛應用于植物基因組學方面的研究，如遺傳圖譜構建、比較作圖、遺傳多樣性評價、種質鑒定、系統(tǒng)發(fā)育與進化研究等［24-29］。Silvia Fluch 等［30］通過14 022個挪威云杉EST序列建立SSR標記并對其進行特征分析，發(fā)現(xiàn)三核苷酸重復基序在數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)最多，五核苷酸和六核苷酸重復基序次之;用特異性引物對擴增60個位點，檢測到測試群體(16個個體)和篩選群體(96個個體)中有27個位點是多態(tài)的。每位點等位基因數(shù)A為2～17個，觀測雜合度Ho為0.075～0.99。該研究檢測到篩選群體中具有很高的遺傳變異，因此認為EST-SSR標記適用于挪威云杉群體功能基因的變異分析。Yanik Bérubé等［31］曾對云杉的EST數(shù)據(jù)庫進行了EST-SSRs特征描述，根據(jù)白云杉，恩氏云杉及北美云杉的數(shù)據(jù)分析獲得629個云杉的特異標記。A'Hara和 Cottrell［14］將利用北美云杉gSSR檢測到的遺傳參數(shù)與在云杉EST文庫中利用微衛(wèi)星標記獲得的遺傳參數(shù)進行比較，結果表明，gSSR檢測到的每位點等位基因數(shù)高于他們之前通過 EST-SSR 檢測［32］到的結果。Rungis等［33］的研究也得出了相同的結論。

1.3.2 STS標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

STS(Sequence-tagged Site，序列標記位點)是在基因組中染色體特定位置上唯一出現(xiàn)的一段已知序列，可以作為界定基因組中染色體片段位置的位標［34］。STS標記兼具RAPD標記的簡便性和 SSR標記的特異性，在云杉群體遺傳分析中得到了應用。Bennuah等［35］對英國西北部哥倫比亞北美云杉和白云杉基因漸滲區(qū)的16個區(qū)域57個家系種子和幼苗的684個個體進行遺傳分析，檢測其STS等位基因頻率，平均STS雜合指數(shù)為0.46～0.95。研究表明群體間遺傳分化顯著，且群體雜合指數(shù)從沿海向陸地逐漸降低，表現(xiàn)出地理上的變異。雜合指數(shù)的多重回歸分析顯示地理間距主導群體間遺傳分化。Perry和 Bousquet［22］應用12個STS標記比較黑云杉群體遺傳多樣性和交配系統(tǒng)在火燒前、后的差異，結果表明3個原跡地群體和4個火燒跡地群體的遺傳雜合度、等位基因數(shù)量、固定指數(shù)都分別相近，群體間遺傳分化不顯著。交配系統(tǒng)指數(shù)在火燒前后也無顯著變化，沒有發(fā)現(xiàn)遠緣雜交種。因此認為跡地上黑云杉并沒有因林火的影響降低遺傳多樣性，交配系統(tǒng)也比較穩(wěn)定。Gapare等［36］對北美云杉8個群體的遺傳多樣性進行研究。根據(jù)其地理分布特點分為核心群體和邊緣群體，對北美云杉群體進行STS分析，結果表明，核心群體的平均期望雜合度與邊緣群體的極為相似，分別為0.58和0.56;但二者近交系數(shù)相差很多，分別為0.03和0.17;核心群體和邊緣群體的基因流分別為9.0和3.5。8個群體中，75%以上的等位基因為常見的廣域基因，只有一個為稀有的局域基因，僅分布于一個不與其他群體相連的核心群體和兩個不相連的邊緣群體。研究證明，在不相連的外圍群體內比相連的核心群體內發(fā)生過的瓶頸作用強烈。因此，建議優(yōu)先對不相連的邊緣群體進行原地保存或擴大樣本進行異地保存，可將稀有基因保存下來。Gapare［37］在之前的北美云杉群體空間遺傳結構研究中，曾對8個核心群體和邊緣群體每群體200個個體進行空間作圖和基于cDNA的STS分子標記分析。對一定間距內個體間的平均共祖系數(shù)檢測結果顯示:在核心群體中，距離50 m的個體間等位基因和基因型的分布是隨機的，共祖值不顯著，而邊緣群體中，相距小于50 m的個體間有相似的多態(tài)性位點基因型，共祖系數(shù)比核心群體的高0.20;當間隔達到500 m時，共組系數(shù)還為正值。研究認為，核心群體繁殖個體的密度相對大，可能導致種子互相覆蓋，制約了空間遺傳結構的發(fā)展，而邊緣群體中繁殖個體密度相對較小，由于子代在母樹很近的地方繁殖，后來又發(fā)生近親繁殖，很多群體在更新世后期的樹種擴張區(qū)域再繁殖，所以等位基因和基因型的分布更具結構性。在制定基因保存策略時，可能需要對更多的邊緣群體種質進行原地保存。研究中有關空間遺傳結構的數(shù)據(jù)可為育種策略的制定和種子資源收集調查提供依據(jù)。

1.3.3 RT-PCR標記在云杉天然群體遺傳研究中的應用

RT-PCR(reverse transcription-PCR，逆轉錄PCR)是將一條RNA鏈逆轉錄成互補的DNA，再以互補的DNA為模板通過PCR進行擴增。該標記的實用性在于可對基因表達進行實時監(jiān)測。Holliday等［38］對具有21 840個特異元件的3個北美云杉群體cDNA微陣列進行群體內和群體間秋季基因表達監(jiān)控。利用該標記可以檢測云杉微陣列芯片數(shù)據(jù)，對其基因表達進行監(jiān)測，然后通過RT-PCR驗證候選基因的微陣列芯片數(shù)據(jù)。研究表明，脫水蛋白、與發(fā)病機制相關或防凍相關的基因，碳水化合物和脂代謝基因以及信號轉到和轉錄調控相關的基因數(shù)量在秋季有所增加。群體間微陣列芯片的早秋和晚秋雜交結果揭示了秋季轉錄體的基本變異，認為一些時間點上的雜交還能反映出對環(huán)境的局部適應，為研究北美云杉耐冷機制提供備了資料。

1.4 基于單核苷酸多態(tài)性的分子標記與云杉天然群體的遺傳研究

SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)標記是個體間發(fā)生的最普遍的遺傳變異形式，在基因組中分布廣泛，比SSR標記密度還要大，平均每1 000個堿基對中就會有一個堿基發(fā)生變異［39］。加之其遺傳穩(wěn)定性很高，具有易實現(xiàn)分析和自動化等優(yōu)點，已成為繼RFLP和SSR標記之后的第三代DNA分子標記，滲透到了云杉屬的遺傳多樣性分析和聯(lián)合作圖等方面的研究。Namroud等［40］對6個白云杉天然群體進行SNP分析，從345個表達基因中檢測到534個SNPs，平均期望雜合度He為0.270，遺傳分化系數(shù)Gst為0.006。研究認為是自然選擇導致白云杉發(fā)生了基因分化。Holliday等［41］以14個北美云杉群體410個個體為材料，檢測與發(fā)芽調控和秋季耐寒有關的基因多態(tài)性并進行關聯(lián)作圖，從200多個表達基因中檢測到768個SNPs。Q聚類和R聚類后，分析28個候選基因的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)這些候選基因與耐寒表型變異和發(fā)芽調控表型變異相關程度分別為28%和34%;推測存在5個與光信號轉導關聯(lián)的重要基因。研究還發(fā)現(xiàn)，很多與表型關聯(lián)的SNP至少與一種氣候變化相關。

2 不同DNA標記檢測云杉屬樹種所獲遺傳參數(shù)的比較與分析

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在評價群體遺傳多樣性水平時，通常涉及到5個遺傳參數(shù):平均多態(tài)位點百分率(P)、平均期望雜合度(He)、平均Shannon指數(shù)(I)、Nei's遺傳分化值(Gst)和基于AMOVA分析的遺傳分化值(Фst)。其中，Gst和Фst為分化指數(shù)Fst的近似值。20世紀80年代，Ayala［42］研究組對主要動植物的遺傳多樣性研究進行了總結，認為P和He是衡量遺傳多樣性水平的重要參數(shù)。隨后，Hamrick［43］研究組的統(tǒng)計結果支持了Ayala等人的報道。而Qian等［44］認為參數(shù)He和I在遺傳多樣性的評估上比P更加有效。近年來，較多遺傳多樣性研究都借助于分子標記的手段，多樣性的分析和評估主要參照Hamrick研究組的統(tǒng)計結果。通過對利用不同標記所獲云杉的遺傳參數(shù)比較分析，具體見表1，認為云杉天然群體遺傳變異豐富，對環(huán)境變化適應能力強，幾乎所有研究表明，群體間存在遺傳分化，但遺傳分化系數(shù)并不高。對相同云杉屬樹種的遺傳多樣性及遺傳分化分析時，由于參試群體數(shù)和個體數(shù)不同，加之采用的DNA標記類型不同，得出的結論不盡相同。

因為不同類型的分子標記探測范圍不同，檢測多態(tài)性的程度不同，所以，分析相同材料所獲遺傳參數(shù)值表現(xiàn)出差異，甚至得出相反的結論。Namroud等［48］在掃描白云杉單核苷酸多態(tài)性基因組的研究中對幾種不同的分子標記進行了比較，該研究通過SNP掃描得到的期望雜合度均低于通過等位酶、RAPD、AFLP、SSR和 ESTP得到的雜合度，原因是SNP檢測雙等位基因，而且等位基因突變率很低，加上植物編碼區(qū)域本來就比非編碼區(qū)域的核苷酸多態(tài)性低，所以得到的多態(tài)位點百分率低，而期望雜合度是通過多態(tài)位點百分率計算而得，所以采用SNP獲得的期望雜合度比采用其他幾種檢測手段檢測到的遺傳多樣性參數(shù)值低。Jeandroz等［49］對6個挪威云杉天然群體的同一套材料，分別應用RAPD和mtDNA標記進行檢測，RAPD的分子方差分析結果顯示6個群體差異顯著，而用mtDNA檢測的分析結果顯示群體間差異不顯著，與RAPD分析結果相悖。對此，作者把兩種標記分析結果產(chǎn)生的矛盾歸結為兩種標記的性質差異，即RAPD檢測雙親遺傳的核DNA，而mtDNA檢測單親遺傳的線粒體DNA。Dumolin-Lapègue 等［50］在該方面提出自己的看法，認為RAPD標記主要從總體上揭示物種的遺傳多樣性，而母系遺傳的線粒體DNA標記更適于描述群體變異和演化路徑。

Scotti等［51］應用 mtVNTRs和 cpSSRs標記對小范圍內的亞高山挪威云杉群體空間結構和風媒(花粉/種子)更新過程進行研究，該研究所用的材料根據(jù)林木胸徑大小分為兩類，即胸徑不小于10 cm的成熟林和胸徑小于10 cm的幼齡林，通過cpSSRs標記檢測到的單體型多樣性(以單體型計數(shù)形式表示，nA=42)高于通過mtVNTRs標記檢測到的單體型多樣性(nA=8)，說明葉綠體標記比線粒體標記檢測的遺傳多樣性高。這與之前Nei［52］用相同材料所得結論一致。Nei的研究是應用兩種標記對成熟林和幼齡林群體分別單獨檢測遺傳多樣性，并將成熟林和幼齡林作為一個整體進行檢測，結果表明cpSSRs檢測到的遺傳多樣性0.736高于mtVNTRs檢測到的遺傳多樣性0.478。Scotti將這一現(xiàn)象歸因于3點:(i)兩種基因組位點的等位基因突變能力存在差異(ii)線粒體和葉綠體基因的遺傳屬性不同。對于云杉而言，線粒體基因為母系遺傳，靠種子傳播，具有有限的基因流;葉綠體基因為父系遺傳，靠種子和花粉傳播，具有廣泛的基因流，因此，用后者檢測的遺傳多樣性相對較高。(iii)用于比較的兩個基因組的標記數(shù)量不同(4個葉綠體標記和2個線粒體標記)。

3 DNA標記在云杉種質資源保存、遺傳改良方面的應用前景

在林木育種工作中，對種質資源的保存通常是對遺傳多樣性資源的保存，即對基因資源的保存。因此，對于云杉而言，通過DNA分子標記研究其天然群體的遺傳結構，所獲數(shù)據(jù)可為育種策略的異地保存提供指導。根據(jù)現(xiàn)有資料顯示，在云杉種質資源保存研究領域，國內外育種專家均主張重視核心種質的保存，以盡可能少的樣本盡可能多的保存其遺傳多樣性，提高種質資源的保存效率。

種質資源的收集與保存是進行遺傳改良的遺傳基礎。云杉屬樹種早期的遺傳改良程序通常是對種和種源進行聯(lián)合選擇，了解不同云杉異地適應性和生產(chǎn)力，再在種源研究基礎上進行種子區(qū)劃，為各造林區(qū)提供最適種源。在優(yōu)良種源區(qū)內，還可以進一步選擇優(yōu)良林分，將其改建成母樹林，或通過表型選優(yōu)，營建實生和無性系初級種子園對優(yōu)良種源進行利用。盡管采用上述方法可達到遺傳改良目的，但選育周期很長，而通過分子標記輔助選擇育種不僅可以克服上述缺點，還可以同時選擇多個性狀，是未來云杉遺傳育種工作中的一個發(fā)展方向。綜上，DNA分子標記在云杉屬樹種的種質資源保存與利用方面具有廣闊的前景。

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