李秀娟，劉軍超，張林西，金春亭，范 婕，李玉珍，李海軍

（1.河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北 張家口075000）

食管癌死亡率較高的主要原因之一是由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者在確診時已達(dá)癌癥的中晚期而延誤了最佳治療時機(jī)。

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23定位于17號染色體的q21.3上，編碼二磷酸核苷激酶，是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，在大多數(shù)惡性腫瘤中nm23低水平表達(dá)者易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1－5]。有研究表明，nm23基因表達(dá)率的降低與腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，且nm23基因的陽性表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，nm23基因表達(dá)陰性的病人的存活率明顯低于表達(dá)陽性的病人。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測食管鱗癌組織中nm23的表達(dá)情況，為探討nm23與食管癌預(yù)后的關(guān)系提供有利的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集2009－06—2010－12月期間河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科切除的食管癌存檔標(biāo)本蠟塊74例。全部病例術(shù)前未經(jīng)任何治療，手術(shù)后病理切片證實(shí)均為食管鱗狀細(xì)胞癌。其中男70例，女4例；中位年齡62歲。高分化鱗癌16例，中分化鱗癌40例，低分化鱗癌18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例；外膜浸潤28例，無外膜浸潤46例。另外收集22例正常食管黏膜組織作為對照。

1.1.2 試劑 鼠抗人nm23單克隆抗體、免疫組化二抗工作液和DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物制品有限公司。試劑均嚴(yán)格按照說明書使用，以確保實(shí)驗(yàn)的可靠性。

1.2 方法

采用免疫組化SP二步法進(jìn)行染色，切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O237℃5min，檸檬酸緩沖液加熱抗原修復(fù)15min，滴加一抗，37℃60min，PBS清洗后滴加二抗，37℃30min，DAB顯色，中性樹膠封片。同時用PBS代替一抗作染色的陰性對照，用已知nm23染色陽性的胃癌組織片做陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷

nm23主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用Image－Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。測定條件：每張切片隨機(jī)觀察5個高倍（10×40）視野計(jì)算均值，平均每高倍視野陽性癌細(xì)胞數(shù)占所觀察癌細(xì)胞總數(shù)的百分率作為陽性結(jié)果，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為（－），10%～50%為（＋），＞50%為（＋＋）[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，nm23蛋白表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌及正常食管組織中nm23的表達(dá)（圖1～2、表1）

圖1 nm23expression in ESCC（IHC200＊ ）

圖2 nm23expression in NEM（IHC200＊）

74例食管癌組織中nm23蛋白陽性表達(dá)率為71.6%（53/74），22例正常組織中nm23蛋白陽性表達(dá)率為95.5%（21/22），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 食管鱗癌中nm23與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（表2）

表1 食管鱗癌與正常食管組織中nm23的表達(dá)

表2 食管鱗癌nm23與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

食管癌組織中nm23蛋白在高中分化組和低分化組陽性表達(dá)率分別為78.6%和50.0%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組nm23蛋白陽性表達(dá)率分別為57.6%和82.9%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示nm23表達(dá)與組織分化和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，而與年齡、性別及浸潤深度無關(guān)。

3 討 論

nm23即腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，1988年被Steeg[7]等用消減雜交法從轉(zhuǎn)移潛力不同的K－1735鼠黑色素瘤細(xì)胞株中分離出來。目前該基因家族有6個成員，其中nm23－H1基因與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切，故臨床上研究最多。nm23－H1基因定位于人類于人類17號染色體上，長度為18kD，含有5個外顯子。

nm23基因編碼的nm23蛋白與二磷酸核苷激酶（NDPK）的氨基酸順序約有89%的同源性。主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，也可見于細(xì)胞膜。因此，nm23蛋白很可能通過與NDPK一致或相似的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的信號傳遞、細(xì)胞分化等過程[8]。NDPK為細(xì)胞提供除ATP外的所有三磷酸核苷，它能使GDP還原為GTP，而GTP可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞膜G蛋白活性，發(fā)揮生長抑制等負(fù)性調(diào)節(jié)功能。提示nm23所具有的功能一旦被破壞，便有可能導(dǎo)致細(xì)胞分化受阻而影響細(xì)胞發(fā)育和促進(jìn)腫瘤發(fā)展。另外，GTP還可直接影響微管、微絲等細(xì)胞骨架蛋白的生物活性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)的狀態(tài)影響紡綞體的形成和細(xì)胞運(yùn)動。如果NDPK出現(xiàn)異常，會發(fā)生紡綞體形成障礙，從而出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞，細(xì)胞運(yùn)動也將出現(xiàn)異常，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

最近研究表明，nm23通過下調(diào)EDG2（內(nèi)皮細(xì)胞分化溶血磷脂酸G蛋白偶聯(lián)受體2）的水平來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。Leone將nm23cDNA導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果表明乳腺癌的轉(zhuǎn)移潛能顯著下降，直接證實(shí)了nm23作為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的功能。目前已明確在胃癌、肝癌、膽囊癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中，nm23基因的高表達(dá)能有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，提高患者預(yù)后水平[10]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法檢測了nm23在食管鱗癌中的表達(dá)。結(jié)果顯示，食管癌組織中nm23的陽性表達(dá)率明顯低于正常食管粘膜組織（P＜0.05），在高中分化食管癌組織中nm23的陽性表達(dá)率（78.6%）明顯高于低分化組（50.0%），在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（82.9%）明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（57.6%）。以上結(jié)果提示nm23蛋白在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)程度越低預(yù)示預(yù)后越差。故食管癌患者手術(shù)前后檢測nm23蛋白的表達(dá)可以用來預(yù)測食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，nm23可作為評價(jià)食管癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

[1]Liu WK，F(xiàn)u Q，Li YM，et al.The relationship between cyclooxygenase－2，CD44v6，and nm23－H1in esophageal squamous cell carcinoma[J].Onkologie，2009，32（10）：574－578.

[2]張?jiān)其h，王軍，杜寧，等.Survivin nm23－H1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（10）：1939－1941.

[3]劉偉，黃超，邢偉.大腸癌中Survivin和nm23－H1的表達(dá)及其聯(lián)合檢測的臨床意義 [J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（19）：2074－2076.

[4]Dong SW，Wang L，Sui J，et al.Expression patterns of ER，HER－2，and NM23－H1in breast cancer patients with different menopausal status：correlations with metastasis [J].Mol Diagn Ther，2011，15（4）：211－219.

[5]Andolfo I，De Martino D，Liguori L，et al.Correlation of nm23－H1cytoplasmic expression with metastatic stage in human prostate cancer tissue [J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2011，384（4－5）：489－498.

[6]Liu WK，F(xiàn)u Q，Li YM，et al.The relationship between cyclooxygenase－2，CD44v6，and nm23－H1in esophageal squamous cell carcinoma [J].Onkologie，2009，32（10）：574－8.

[7]Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence or a novel gene associated with low tumor metastatic potential[J].J Natl Cancer Inwst，1988，80（3）：200－204.

[8]Buxton IL，Yokdang N.Extracellular nm23signaling in breast cancer：incommodus verum [J].Cancers（Basel），2011，3（3）：2844－2857.

[9]Horak CE，Lee JH，Elkahloun AG，et al.nm23－H1suppresses tumor cell motility by down－regulating the lysophosphatidic acid receptor EDG2 [J].Cancer Res，2007，67（15）：7238－7246.

[10]Yang YQ，Wu L，Chen JX，et al.Relationship between nm23－H1genetic instability and clinical pathological charac teristics in Chinese digestive system cancer patients [J].World J Gastroenterol，2008，14（36）：5549－5556.