李敬東 梁銳英 徐艷麗 李金源

牙齦癌是常見的口腔惡性腫瘤之一，目前牙齦癌的治療以手術(shù)切除為主，但常會造成患者顏面部的缺損和畸形[1]。本研究旨在檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）在牙齦癌中的表達情況，探討其與牙齦癌臨床病理分型間的關(guān)系，為牙齦癌的生物學治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月—2011年9月于本院就診的牙齦癌患者33例，其中發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，術(shù)后復發(fā)7例。依分化程度分為低分化組8例，男4例，女4例，年齡32～73歲，中位年齡為58歲；中分化組10例，男4例，女6例，年齡35～69歲，中位年齡55歲；高分化組15例，男7例，女8例，年齡21～77歲，中位年齡56歲。同期隨機從癌旁的正常牙齦組織中抽取8例（癌旁組織組），男4例，女4例，年齡 37～69歲，中位年齡 52歲。各組性別（χ2=0.439）、年齡（Z=5.306）差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 主要試劑 pv6000兩步法免疫組化試劑盒、DAB Kit顯色試劑盒及Mouse anti-PTEN（ZM-0221，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Rabbit anti-MMP-9（Matrix Metalloproteinase 2，bs-0397R）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法 將手術(shù)所取標本先進行HE染色，確定所取標本的病理性質(zhì)。免疫組織化學檢測采用SP法染色。所有切片均由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生進行雙盲閱片，MMP-9以細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，PTEN以細胞漿和 （或）細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。在Motic Med 6.0軟件系統(tǒng)鏡下采圖，每張切片隨機攝取10個視野，在光鏡下放大400倍，分析其陽性細胞表達的積分光密度（IOD）值，光密度定標值為255。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法檢驗。計數(shù)資料用率（%）表示，組間比較行卡方檢驗及確切概率法，MMP-9及PTEN之間相關(guān)性及其與臨床特征的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9和PTEN在各組中的病理表達 （1）MMP-9病理表達。癌旁組織組陽性表達者胞漿可見棕黃染色，為弱陽性表達、彌散分布，見圖1。高分化組陽性表達者在胞漿中可見彌散分布的棕黃染色，為弱陽性表達，見圖2。中分化組陽性表達者胞漿廣泛出現(xiàn)較深的棕黃染色，見圖3。低分化組胞漿中出現(xiàn)深棕黃染色，且細胞膜也出現(xiàn)明顯黃染，為強陽性表達，見圖4。（2）PTEN病理表達。癌旁組織組蛋白主要定位在細胞質(zhì)和細胞核，呈棕黃色、彌散分布，表達強度較高，見圖5。高分化組PTEN陽性表達者棕黃染色在細胞核和細胞質(zhì)中彌散分布，染色較深，表達為強陽性，見圖6。中分化組陽性表達者在細胞核和細胞質(zhì)中棕黃染色散在分布，表達為弱陽性，見圖7。低分化組在細胞核和細胞質(zhì)中均未見棕黃染色，全部為陰性表達，見圖8。

2.2 各組MMP-9和PTEN的陽性表達率及IOD值比較 （1）MMP-9表達情況。癌旁組織組表達比例低于中、低分化組，高分化組低于低分化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組IOD值比較，除癌旁組織組和高分化組，高、中分化組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）外，其余各組間均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。（2）PTEN表達情況。PTEN陽性率癌旁組織組高于中、低分化組，高分化組高于低分化組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組間IOD值兩兩比較，除癌旁組織與高分化組間差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

Figure 1 Expression of MMP-9 in gingival tissues adjacent to cancer（SP×400）圖1 MMP-9在癌旁牙齦組織中的表達（SP×400）

Figure 2 Expression of MMP-9 in well differentiated gingival cancer（SP×400）圖2 MMP-9在高分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 3 Expression of MMP-9 in moderately differentiated gingival cancer（SP×400）圖3 MMP-9在中分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 4 Expression of MMP-9 in poorly differentiated gingival cancer（SP×400）圖4 MMP-9在低分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 5 Expression of PTEN in gingival tissues adjacent to cancer（SP×400）圖5 PTEN在癌旁牙齦組織中的表達（SP×400）

Figure 6 Expression of PTEN in well differentiated gingival cancer（SP×400）圖6 PTEN在高分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 7 Expression of PTEN in moderately differentiated gingival cancer（SP×400）圖7 PTEN在中分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 8 The negative expression of PTEN in poorly differentiated gingival cancer（SP×400）圖8 PTEN在低分化牙齦癌中的陰性表達（SP×400）

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果 MMP-9和PTEN在牙齦癌中的陽性表達呈負相關(guān)（rs=-0.949，P<0.05）。MMP-9及PTEN的表達率與性別、年齡均無相關(guān)性（P＞0.05）。MMP-9表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復發(fā)呈正相關(guān)，PTEN的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復發(fā)呈負相關(guān)（P<0.05），見表2。

Table 1 Comparison of expressions of MMP-9 and PTEN between four groups表1 4組MMP-9和PTEN表達情況的比較

Table 2 Correlation between positive expressions of MMP-9 and PTEN and clinical features in patients with gingival cancer表2 牙齦癌患者MMP-9和PTEN表達與各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討論

研究認為，細胞外基質(zhì)（ECM）是腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的必經(jīng)通道，基質(zhì)金屬蛋白酶類(Matrixmetalloproteinases，MMPs)尤其是MMP-9與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切[2-3]。PTEN基因是具有磷酸酶活性的一種重要的抑癌基因，對細胞周期調(diào)控起著重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，口腔鱗狀細胞癌中PTEN基因常出現(xiàn)異常表達[4]。但具體關(guān)于PTEN在牙齦癌中的表達及其與其他因子之間的關(guān)系尚少見報道。本研究顯示，MMP-9在癌旁組織組的表達率低于中、低分化組，且隨著分化程度的降低，表達率呈增高趨勢。雷志敏等[5]在研究MMP-2、MMP-9及腫瘤抑制基因脆性組氨酸三位體（FHIT）在口腔鱗癌組織中的表達發(fā)現(xiàn)MMP-9在正?？谇火つぶ械谋磉_率為26.67%，隨分化程度降低，2種蛋白的表達率隨之增高，與本研究結(jié)果一致。免疫組化染色結(jié)果顯示，低分化組在胞漿和包膜上均呈深棕染色，表明低分化組MMP-9強陽性表達，同時IOD值結(jié)果也近一步證實，分化程度越低，IOD值越大。Cupic′等[6]研究證實，MMP-9在腫瘤組織的表達高于良性腫瘤和正常組織。通常腫瘤壞死因子 (TNF)-α可誘導MMP-9合成增加。Hyc等[7]在研究大鼠膝關(guān)節(jié)細胞時發(fā)現(xiàn)，TNF-α作用于MMP-9基因促進其轉(zhuǎn)錄過程，從而引起MMP-9水平上調(diào)。但牙齦癌中造成MMP-9表達增加的具體機制仍有待于進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)PTEN在癌旁組織中的表達率為100%，且隨著分化程度降低，PTEN的表達率也隨之降低，癌旁組織組和高分化組與中低分化類型牙齦癌比較差異有統(tǒng)計學意義，提示隨著牙齦癌分化程度的降低，PTEN陽性表達率有下降的趨勢。目前大多數(shù)觀點認為，PTEN通過它的脂質(zhì)磷酸酶的活性參與細胞凋亡過程，從而可抑制腫瘤的發(fā)生[8]。也有研究認為，PTEN基因可能發(fā)生突變，導致酶活性急劇下降，致腫瘤細胞惡性增殖能力增強[9]。本研究結(jié)果證實，PTEN的陽性表達率隨分化程度降低而降低，表明其可能在牙齦癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，但PTEN在牙齦癌中如何發(fā)揮作用仍需進一步研究證實。

本研究結(jié)果顯示，MMP-9的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)呈正相關(guān)，表明MMP-9的表達增高可能會促進牙齦癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。另外，PTEN的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)呈負相關(guān)，表明PTEN陽性表達時患者淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移和術(shù)后復發(fā)的概率較低，而陰性表達的患者，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后較易復發(fā)。MMP-9和PTEN呈負相關(guān)，提示MMP-9的高表達和PTEN的低表達在牙齦癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中共同發(fā)揮作用，但有關(guān)其具體作用機制尚有待進一步研究證實。

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