趙艷茹 劉 波 齊曦明 尹福在

胰島素抵抗是2型糖尿?。═2DM）的核心機(jī)制，有研究證實(shí)胰島素抵抗與慢性低水平的炎癥狀態(tài)和一些細(xì)胞因子相關(guān)[1]。在T2DM發(fā)生發(fā)展中，炎癥因子可能具有重要作用[2]。CXCL5/ENA-78即上皮細(xì)胞來源的中性粒細(xì)胞活化肽，是趨化因子超家族的CXC亞族成員，參與多種炎癥反應(yīng)。本研究旨在探討CXCL5基因啟動(dòng)子區(qū)-156 G/C位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年2月—10月在我院內(nèi)分泌科住院的T2DM患者210例為T2DM組，男女各105例，年齡（54.09±12.43）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（25.38±3.67）kg/m2，診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除伴有急慢性感染性疾病、嚴(yán)重心腦血管病變、肝腎功能不全及嚴(yán)重T2DM急性代謝并發(fā)癥者。選取同期我院體檢中心的健康體檢者171例為對(duì)照組，男88例，女83例，年齡（52.64±11.46）歲，BMI為（25.16±3.48）kg/m2，2組間性別（χ2=0.283）、年齡（t=1.175）、BMI（t=0.601）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P>0.05）。

1.2 主要儀器試劑 PCR擴(kuò)增儀Mastercycler T-Gradinet（德國Eppendorf公司），DYCZ-28A型電泳槽（北京市六一儀器廠），恒溫孵育箱。人全血DNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司），Taq-DNA聚合酶、NruⅠ限制性內(nèi)切酶（Promega公司）。

1.3 研究方法 2組均采空腹外周靜脈血2 mL，提取白細(xì)胞基因組DNA。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測CXCL5基因啟動(dòng)子區(qū)-156 G/C基因多態(tài)性。引物序列均查基因庫并參考文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，上游引物5′-CTCCTCCTGGCCACCCTCGC-3′，下游引物 5′-TCAAGCTTTG GGATGCTGGGGAA-3′（上海捷瑞生物工程有限公司合成）。PCR擴(kuò)增片段長度114 bp，分離純化擴(kuò)增產(chǎn)物，測序并與GenBank中CXCL5基因比較。以限制性內(nèi)切酶NruⅠ進(jìn)行消化，酶切產(chǎn)物用經(jīng)15%聚丙烯酰胺電泳溴乙錠染色，凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件完成，計(jì)量資料用±s表示，兩個(gè)樣本比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布資料做自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后再行t檢驗(yàn)。遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)用Hardy-Weinberg平衡法。各組間基因頻率、等位基因頻率比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)，并對(duì)基因型及等位基因頻率分布進(jìn)行相對(duì)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分析，計(jì)算比值比（odds ratio,OR）及其95%可信區(qū)間。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物基因測序結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物片段為114bp，將產(chǎn)物測序并與GenBank中CXCL5基因啟動(dòng)子區(qū)-156 G/C的基因序列進(jìn)行比較，與相應(yīng)序列完全一致，見圖1～3。

Figure 1 G/G homozygous genotype圖1 G/G基因型

Figure 2 G/Cheterozygous genotype圖2 G/C基因型

Figure 3 C/Chomozygous genotype圖3 C/C基因型

2.2 2組CXCL5啟動(dòng)子-156G/C位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布 CXCL5基因啟動(dòng)子-156G/C的基因型分布分符合Hardy-Weinberg平衡，見表1。T2DM組和對(duì)照組基因型和等位基因分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見表2。

Table 1 Hardy-Weinberg analysis表1 Hardy-Weinberg基因平衡檢驗(yàn)（實(shí)際觀察值/理論值）

Table 2 CXCL5 polymorphism genotype and allelotype frequency in two groups表2 2組CXCL-5基因型及等位基因頻率分布

2.3 CXCL5-156G/C位點(diǎn)多態(tài)性 G/G基因型可被酶切為95 bp和19 bp片段，G/C基因型可被酶切為114 bp、95 bp和19 bp片段，C/C基因型不可被酶切，可見1條114 bp的電泳帶，見圖4。

Figure 4 The CXCL5-156G/CSNPgenotyping by PCR-NRUI digestion and PCR production圖4 CXCL5-156G/C基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切電泳圖

3 討論

趨化因子能通過炎癥反應(yīng)參與糖尿病與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展，與其他機(jī)制共同加快糖尿病病程的進(jìn)展。CXCL5/ENA-78參與炎癥、腫瘤、自身免疫病、超敏反應(yīng)及獲得性免疫缺陷綜合征多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。CXCL5基因位于染色體4q13～q21，其中有2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)：啟動(dòng)子區(qū)域的-156G＞C（rs352046），外顯子 398G＞A（rs425535），而啟動(dòng)子區(qū)域-156G/C的基因多態(tài)性影響基因表達(dá)水平[4]。并且Zineh等[5]的研究表明-156位點(diǎn)攜帶C等位基因者其血漿CXCL5濃度顯著升高，并直接影響白細(xì)胞產(chǎn)生CXCL5。目前國內(nèi)外關(guān)于CXCL5與2型糖尿病的相關(guān)性研究較少，Alfadda等[6]研究證實(shí)糖尿病患者血清CXCL5水平明顯高于對(duì)照組。

本研究顯示2型糖尿病組和對(duì)照組基因型和等位基因分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C等位基因并不增加糖尿病的發(fā)病率，提示CXCL5酶切位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病有較弱的遺傳關(guān)聯(lián)性，研究結(jié)果與近期國外報(bào)道不一致。分析其可能的原因有：（1）樣本量有限，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量；在缺乏更大樣本的臨床研究資料之前，評(píng)價(jià)兩者之間的關(guān)系應(yīng)慎重。（2）CXCL5在T2DM發(fā)病中所起的作用比較弱。（3）不同種族、地區(qū)和群體在遺傳和表型上存在異質(zhì)性，CXCL5酶切位點(diǎn)的基因型在不同種族和群體中分布頻率不一。（4）T2DM是復(fù)雜性的多基因遺傳病，是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。CXCL5單個(gè)基因多態(tài)性只能改變個(gè)體對(duì)疾病的易感性，其可能需與其他基因或環(huán)境因素共同影響疾病的發(fā)生。

CXCL5-156G/C位點(diǎn)的基因多態(tài)位點(diǎn)在國內(nèi)文獻(xiàn)少見報(bào)道，因而筆者不能斷言CXCL5酶切位點(diǎn)的多態(tài)性與T2DM的發(fā)病無關(guān)。有待進(jìn)一步加大樣本量，開展多地區(qū)、多種族人群的大規(guī)模前瞻性研究和譜系研究。

[1]Tilg H,Moschen AR.Inflammatory mechanisms in the regulation of insulin resistance[J].Mol Med,2008,14(3-4):222-231.

[2]李秀鈞，鄔云紅.糖尿病是一種炎癥性疾病[J]?中華內(nèi)分泌代謝雜志,2003,19(4):251-253.

[3]Hasani Ranjbar S,Amiri P,Zineh I.CXCL5 gene polymorphism association with diabetes mellitus[J].Mol Diagn Ther,2008，12(6):391-394.

[4]Amoli MM,Larijani B,Thomson W,etal.Two polymorphisms in the epithelial cell-derived neutrophil-activating peptide(ENA-78)gene[J].Dis Markers,2005,21(2):75-77.

[5]Zineh I,Aquilante CL,Langaee TY,etal.CXCL5 genepolymorphisms are related to systemic concentrations and leukocyte production of epithelial neutrophil-activating peptide (ENA-78)[J].Cytokine，2006,33(5):258-263.

[6]Alfadda AA,Alzoghaibi MA.Circulatory neutrophil chemokines in statin-treated diabetic patients[J].Saudi Med J,2008,29(4):584-588.