鐘繼娟 繆 珩

糖尿病腎?。╠iabeticn ephropathy，DN）是糖尿病晚期最主要的并發(fā)癥之一。DN主要表現(xiàn)為腎臟肥大、腎小球及腎小管基底膜增厚、腎小球內(nèi)高灌注、高跨膜壓并逐漸進展為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)增生、腎小球硬化，最終發(fā)展為腎功能衰竭[1]，已成為糖尿病患者最主要的死亡原因之一。DN發(fā)生發(fā)展的危險因素除高血糖之外，還與高血壓、高血脂、胰島素抵抗（IR）等有關(guān)。目前常用的治療DN的藥物有代文、阿托伐他汀和匹格列酮，有研究表明這3種藥物均具有獨立于其基本的降壓、降脂、改善IR作用之外的腎臟保護作用[2-5]，但其作用機制尚不明確。本研究采用體外培養(yǎng)的方法，分別觀察3種藥物對高糖條件下培養(yǎng)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、纖維連接蛋白（Laminin，LN）、Ⅳ型膠原（Type Ⅳ Collagen，C-Ⅳ）、TGF-β1mRNA、腎上腺髓質(zhì)素 （adrenomedullin，AM）mRNA以及補體因子H （complement factor H，Cfh）mRNA 表達(dá)的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)保藏中心）。RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國GIBCO BRL公司），新生胎牛血清 （NCS，杭州四季青公司），4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，美國 Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司）。匹格列酮標(biāo)準(zhǔn)品系恒瑞公司惠贈，TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（美國 Genzyme公司），LN和C-Ⅳ放免測定試劑盒（上海海軍醫(yī)學(xué)研究所生物技術(shù)中心），Trizol（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制 代文、阿托伐他汀和匹格列酮均用DMSO溶解，然后用不完全RPMI-1640培養(yǎng)基配成0.03 mmol/L母液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) （1）將HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，實驗共分為：低糖對照（5.6 mmol/L，LG）、高糖對照（30 mmol/L，HG）、高糖+代文（10 μmol/L，HD）、高糖+阿托伐他?。?0 μmol/L，HL）、高糖+匹格列酮（10 μmol/L，HP）5 組。（2）細(xì)胞傳代 48 h（傳代前每瓶細(xì)胞數(shù)約5×104/mL，每瓶細(xì)胞懸液6 mL），棄去上清液，加入 LG、HG、HD、HL或HP的培養(yǎng)液，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，干預(yù)48 h后分別取細(xì)胞上清液分裝于 Eppendorf管，-20 ℃冰箱保存，用于 TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原蛋白測定，并立即提取系膜細(xì)胞總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取及RT-PCR （1）采用Trizol一步法抽提細(xì)胞總RNA，RNA濃度用比色法測定光密度 （OD）值，RNA完整性用甲醛變性膠電泳驗證。（2）用RT-PCR方法半定量測定藥物剌激對體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達(dá)的影響，以GAPDH為內(nèi)參照。TGF-β1引物序列：上游 5′-CTTCAGCTCCACAGAG AAGAACTG-3′，下游 5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTC C-3′，產(chǎn)物 298 bp；AM 引物序列：上游 5′-GAAGCTGGTTTC CATCGCCC-3′，下游 5′-TGCCACCCGCACCTATAACC-3′，產(chǎn)物568 bp；Cfh引物序列： 上游 5′-AAGTTATCTGTCCCTCCC T-3′,下游 5′-CATACTCCTGCTTTTGTCTA-3′，產(chǎn)物 256 bp；GAPDH引物序列：上游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATAT TC-3′， 下游 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，產(chǎn)物196 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，取RNA樣本4.0μL加入隨機引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶3μL進行逆轉(zhuǎn)錄。以GAPDH檢測陽性的cDNA為模板，用特異性引物擴增cDNA。PCR反應(yīng)體系為25μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）2.0μL，上、下各游引物0.5μL，Taq酶0.4μL進行PCR擴增。取PCR產(chǎn)物10μL在2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）上電泳，用天能GIS-2010數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，測定OD值并計算TGF-β1/GAPDH、AM/GAPDH和Cfh/GAPDH的 OD比值。

1.2.4 細(xì)胞上清測定 TGF-β1采用ELISA試劑盒，LN和Ⅳ型膠原采用RIA試劑盒，均按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件處理，計量資料以±s表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種藥物對TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達(dá)的影響 高糖對照組細(xì)胞上清TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原的表達(dá)顯著高于低糖對照組（均P<0.001）。高糖條件下予以藥物干預(yù)后，與高糖對照組比較，HD組、HL組及HP組細(xì)胞上清TGF-β1、Ⅳ型膠原、LN的表達(dá)顯著下降 （均P<0.001），且HD組作用更明顯，見表1。

Table 1 Effects of TGF-β1,LN,typeⅣ collagen expressions in mesangial cells cultured under high glucose in five groups表1 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達(dá)水平影響 （n=4，μg/L，±s）

Table 1 Effects of TGF-β1,LN,typeⅣ collagen expressions in mesangial cells cultured under high glucose in five groups表1 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達(dá)水平影響 （n=4，μg/L，±s）

**P<0.01

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2.2 3種藥物對 TGF-β1mRNA、AM mRNA和 Cfh mRNA表達(dá)的影響 高糖條件下系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA的表達(dá)較低糖對照組顯著增高 （均P＜0.001）。應(yīng)用藥物干預(yù)后，TGF-β1mRNA、AM mRNA 和 Cfh mRNA 的表達(dá)較高糖對照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），見圖1～3、表2。

Figure 1 The electropherogram of TGF-β1mRNA expression in different groups of mesangial cells圖1 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)電泳圖

Figure 2 The electropherogram of AM mRNA in different groups of mesangial cells圖2 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞AM mRNA表達(dá)電泳圖

Figure 3 The electropherogram of Cfh mRNA in different groups of mesangial cells圖3 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞Cfh mRNA表達(dá)電泳圖

Table 2 Comparison of expressions of TGF-β1 mRNA,AM mRNA and Cfh mRNA in different groups of mesangial cells表2 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達(dá)水平的比較 （n=4，OD 值，±s）

Table 2 Comparison of expressions of TGF-β1 mRNA,AM mRNA and Cfh mRNA in different groups of mesangial cells表2 各組大鼠腎臟系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達(dá)水平的比較 （n=4，OD 值，±s）

**P<0.01

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3 討論

DN是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制復(fù)雜，主要包括腎小球系膜細(xì)胞的增厚擴張、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積、間質(zhì)病變和腎小管病變等，其中TGF-β1改變在DN進行性腎小球硬化過程中起著重要作用。臨床資料顯示，除基本的影響因素如糖尿病患者年齡、病程長以及血糖控制情況之外，肥胖、高血壓及高血脂等胰島素抵抗癥候群在DN的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用[6]。代文、阿托伐他汀和匹格列酮是目前臨床上常用的降壓、降脂及改善IR的藥物，本研究結(jié)果顯示這3種藥物均能顯著降低高糖誘導(dǎo)的TGF-β1、LN及Ⅳ型膠原的表達(dá)水平，呈現(xiàn)出一定的腎臟保護作用。

AM是一種強有力的血管舒張性多肽，屬降鈣素基因相關(guān)肽超家族，廣泛分布于心血管系統(tǒng)、肺以及腎臟中[7]，最主要的作用是通過擴血管、利尿而維持心血管和腎功能穩(wěn)態(tài)。AM在腎小管上皮細(xì)胞有拮抗TGF-β1和促ECM沉積的效應(yīng)，從而抑制腎小球硬化的發(fā)展[8]。此外，AM還可抑制血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ的釋放，拮抗 AngⅡ的縮血管和平滑肌細(xì)胞增殖的作用[9]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)用外源性AM干預(yù)時，AngⅡ和TGF-β1的水平下降，提示AM有抑制AngⅡ和TGF-β1的作用，因此DN患者AM合成釋放增多是機體對腎臟的代償性保護作用[10]。Cfh是一種糖蛋白，是補體系統(tǒng)激活中的一個重要的調(diào)節(jié)因子。近來研究表明Cfh是AM的一種結(jié)合蛋白[11]。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)AM對DN具有一定的保護作用，而Cfh可通過增強AM的作用，從而發(fā)揮對糖尿病腎臟的保護作用[12]。

腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng) （RAS）活性在DN早期即有所升高，而這一系統(tǒng)在DN的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色，過度激活的RAS系統(tǒng)通過促進TGF-β1的表達(dá)誘發(fā)腎臟病變。高血糖、高循環(huán)張力、AngⅡ、糖基化終末產(chǎn)物以及前列腺素類物質(zhì)等均可以刺激腎臟系膜細(xì)胞過度分泌TGF-β1，而TGF-β1又可進一步促進ECM的沉積[13]。目前AngⅡ受體拮抗劑類藥物防治DN的大型臨床研究已經(jīng)取得了可喜的結(jié)果，然而該類藥物的腎臟保護作用機制尚未完全明了。本研究用代文干預(yù)高糖培養(yǎng)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞，結(jié)果顯示代文能有效降低高糖誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)，同時LN和Ⅳ型膠原的含量也相應(yīng)下降，并且伴有AM和Cfh的反應(yīng)性下降。因此筆者認(rèn)為，代文的腎臟保護作用可能是由于其抑制TGF-β1的表達(dá)并進一步降低ECM的沉積而介導(dǎo)的。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有著廣泛的調(diào)脂之外的作用，如抑制細(xì)胞增生、促進腫瘤細(xì)胞凋亡[14]以及免疫調(diào)節(jié)等[15]。Kim等[16]報道洛伐他汀能顯著改善鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的腎小球硬化和白蛋白尿，這種保護作用可能為血脂改善的結(jié)果。由于本實驗是體外培養(yǎng)研究，不存在高脂因素的影響，因此筆者認(rèn)為阿托伐他汀的腎臟保護作用是獨立于其降脂作用之外的，其機制可能是由于其抑制TGF-β1的表達(dá)并進一步降低ECM的沉積而介導(dǎo)的。

噻唑烷二酮類（thiazolidinediones，TZDs）是一類新型的胰島素增敏劑，其主要作用是改善IR及相關(guān)代謝紊亂。TZDs的靶分子過氧化物酶體增殖活化受體（PPAR）-γ是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族的成員，主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞和脾細(xì)胞，在腎臟系膜細(xì)胞也有一定數(shù)量的表達(dá)，在脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝中起著重要作用。Isshiki等[17]報道TZDs能抑制甘油二酯-蛋白激酶C-胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Diacylglycerol-Protein kinase C-Extracellular signal-regulated kinase，DAG-PKC-ERK） 途徑激活，且指出TGF-β1的表達(dá)受蛋白激酶C-胞外信號調(diào)節(jié)激酶 （Protein kinase C-Extracellular signal-regulated kinase,PKC-ERK）途徑的調(diào)控。因此認(rèn)為，匹格列酮的腎臟保護作用至少部分是由于其抑制TGF-β1的表達(dá)并進一步降低ECM的沉積所致。

綜上所述，代文、阿托伐他汀和匹格列酮干預(yù)后TGF-β1、AM和Cfh的表達(dá)較高糖對照組均顯著下降，機制可能與其抑制TGF-β1的表達(dá)并進一步降低LN和Ⅳ型膠原的沉積有關(guān)。

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