丁曉松 李衛(wèi)萍 沈絮華 武 星 李虹偉

冠心病患者常合并糖代謝異常，糖尿病作為冠心病的等危癥可通過(guò)胰島素抵抗、氧化應(yīng)激等機(jī)制引起內(nèi)皮功能障礙及血管舒縮功能異常[1]。RhoA/ROCK信號(hào)通路是近年來(lái)研究較多的一個(gè)參與血管舒縮功能調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。RhoA通過(guò)激活ROCK使肌球蛋白輕鏈活化并抑制其失活，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞（VSMC）收縮[2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）和Rho/ROCK通路均可通過(guò)影響NO合成酶（eNOS）和NO導(dǎo)致血管功能紊亂[3]。有研究顯示具有部分過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ激動(dòng)作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1）阻滯劑替米沙坦能改善糖尿病時(shí)血管內(nèi)皮功能[4]。本文旨在通過(guò)觀察替米沙坦對(duì)胰島素抵抗大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA及ROCK表達(dá)水平的影響，初步探討Rho/ROCK通路是否參與替米沙坦對(duì)糖代謝異常時(shí)血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠34只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所動(dòng)物部進(jìn)行喂養(yǎng)。尼康SMZ645體視解剖顯微鏡，Mastercycler普通 PCR儀，Gene Amp PCR DG-II暗箱式紫外透箱儀，Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell電泳儀 ，山羊抗大鼠 ROCK1抗體（SANTA，sc-6055），山羊抗大鼠 ROCK2抗體（SANTA，sc-1851），家兔抗大鼠 RhoA 抗體 （Bioworld，BS1782），替米沙坦（Tel）片購(gòu)于上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購(gòu)于Invitrogen生物技術(shù)有限責(zé)任公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈?gòu)于ProMab公司，天然膜蛋白抽提試劑盒和天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒購(gòu)于MERCK公司。

1.2 方法

1.2.1 胰島素抵抗大鼠模型建立 34只大鼠，每籠3只分籠喂養(yǎng)，置于溫度22℃～24℃，濕度60%，每日光照12 h，自由飲水的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取24只大鼠予高果糖飼料喂養(yǎng)，高果糖飼料購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。喂養(yǎng)4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）25 mg/kg，2周后禁食12 h進(jìn)行剪尾法采血，測(cè)定空腹血糖(FBG)濃度，放射免疫法測(cè)定空腹血清胰島素（FSI）濃度，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI），ISI=-ln（FBG×FSI），ISI≤ -4.88 說(shuō)明造模成功。共20只大鼠造模成功，3只造模失敗，1只死亡。將造模成功的20只大鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，胰島素抵抗（IR）組給予生理鹽水灌胃，替米沙坦干預(yù)（Tel）組給予替米沙坦5 mg/（kg·d）灌胃，干預(yù)4周，干預(yù)結(jié)束后分離冠脈進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。未造模的10只大鼠為對(duì)照組。

1.2.2 測(cè)定冠狀動(dòng)脈組織中RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA表達(dá)的水平 干預(yù)結(jié)束后,無(wú)菌條件下取出3組大鼠心臟，在尼康SMZ645體視解剖顯微鏡下迅速分離冠狀動(dòng)脈放入凍存管中，置于液氮中保存。組織勻漿后按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取冠脈組織總RNA，用RT-PCR法分別測(cè)定冠狀動(dòng)脈組織中 RhoA、ROCK1和 ROCK2的 mRNA表達(dá)水平。根據(jù)GenBank搜索結(jié)果以Primer 5.0程序設(shè)計(jì)引物。RhoA引物序列： 上游 5′-CATCCCAGAAAAGTGGACTCCA-3′， 下游 5′-CCTTGTGTGCTCATCATTCCG-3′， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 103 bp。ROCK1引物序列：上游5′-GAATGACATGCAAGCGCAAT-3′，下游 5′-GTCCAAAAGTTTTGCACGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 113 bp。ROCK2引物序列： 上游 5′-GAAACAACTGG ATGAAGCTAATGC-3′， 下游 5′-GTTTCAAGCAGGCAGTTTT TATCTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度150 bp。PCR反應(yīng)條件95℃50 s，60℃ 60 s，72℃60s，循環(huán)45次。

1.2.3 Western blotting測(cè)定RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)水平 采用Total protein Extraction Kit組織裂解提取總蛋白，采用天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtractTM（M-PEK）提取膜蛋白，采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒NucBusterTMProtein Exaction Kit提取漿/核蛋白，采用 10%進(jìn)行 SDSPAGE，山羊抗大鼠 ROCK1 抗體（1∶500），山羊抗大鼠 ROCK2抗體（1∶500）4℃封閉過(guò)夜后再與二抗兔抗山羊 IgG/HRP（1∶40 000）孵育 2 h。兔抗大鼠 RhoA 抗體（1∶500）4℃封閉過(guò)夜后再與二抗山羊抗小鼠IgG/HRP1∶50 000孵育2 h。免疫印跡用化學(xué)發(fā)光法顯示，經(jīng)Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分別計(jì)算RhoA/GAPDH、ROCK1/GAPDH、ROCK2/GAPDH的比值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組間糖代謝指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，IR組大鼠FBG、FSI均升高，而ISI明顯降低，達(dá)到胰島素抵抗水平。Tel組較IR組FBG降低，ISI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FSI無(wú)明顯變化，見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of glucose metabolism index between three groups表1 3組間糖代謝指標(biāo)比較 （n=10，±s）

Table 1 Comparison of glucose metabolism index between three groups表1 3組間糖代謝指標(biāo)比較 （n=10，±s）

*P<0.05，表2、3同

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2.2 3 組間 RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA 水平的比較 3組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA和ROCK2 mRNA表達(dá)水平接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IR組大鼠ROCK1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。而其他各組之間ROCK1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2、圖1。

2.3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較 IR組大鼠RhoA蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和Tel組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而Tel組與對(duì)照組間RhoA蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3、圖2。ROCK1 蛋白表達(dá)水平在3組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。IR組和Tel組ROCK2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IR組和Tel組間ROCK2蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖3。

Table 2 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 mRNA expressions between three groups表2 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平比較（n=10，±s）

Table 2 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 mRNA expressions between three groups表2 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平比較（n=10，±s）

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Figure 1 RT-PCR detection of ROCK1圖1 ROCK1 RT-PCR結(jié)果

Table 3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 protein expressions between three groups表3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

Table 3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 protein expressions between three groups表3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平比較（n=10，±s）

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Figure 2 Westen blotting detection of RhoA protein expression圖2 RhoA蛋白表達(dá)Westen blotting結(jié)果

Figure 3 Westen blotting detection of ROCK2 protein expression圖3 ROCK2蛋白表達(dá)Westen blotting結(jié)果

3 討論

Rho/ROCK信號(hào)通路是近些年心血管系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)，在冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起到一定作用[2,5]。有研究顯示血管緊張素Ⅱ受體可能參與內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞Rho/ROCK信號(hào)通路的激活并有可能通過(guò)該途徑影響血管舒縮功能[6]。Rho是一種小分子G蛋白，在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開(kāi)關(guān)，Rho激酶是小G蛋白下游的效應(yīng)器之一，通過(guò)使肌球蛋白輕鏈磷酸化和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的肌球蛋白結(jié)合亞基（myosin binding subunit，MBS）磷酸化，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞收縮[5]。Rho/ROCK激酶信號(hào)通路可以通過(guò)對(duì)VSMC的作用介導(dǎo)血管緊張度的改變，調(diào)節(jié)血管阻力，參與高血壓的發(fā)生和發(fā)展[7]。自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs）在高血壓發(fā)生之前 Rho激酶的表達(dá)和活性都有所提高[8]。ROCK抑制劑Y-27632可降低多種系統(tǒng)性高血壓大鼠模型的全身血壓，但對(duì)正常動(dòng)物的血壓并沒(méi)有顯著影響，提示Rho/ROCK通路很大程度上參與了高血壓的發(fā)病機(jī)制[7]。Y-27632類似物Fasudil的治療效果在給予長(zhǎng)期輸入血管緊張素Ⅱ造成的高血壓和冠狀血管病變特征的大鼠模型中也得到證實(shí)[2,5]，提示Rho/ROCK信號(hào)途徑可能與RASS系統(tǒng)存在相互作用，而血管緊張素受體阻斷劑（ARB）類藥物可能對(duì)Rho/ROCK信號(hào)途徑具有調(diào)節(jié)作用。

在VSMC中AngⅡ是通過(guò)何種機(jī)制導(dǎo)致RhoA活化尚不清楚。Sayk等[9]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病發(fā)病初期AT1蛋白表達(dá)水平即明顯上調(diào)。Rho GDI是調(diào)節(jié)RhoA活性的小分子蛋白，起抑制RhoA活化作用[10]。Bian等[11]分別給予AngⅡ和AT1阻滯劑L158809處理培養(yǎng)的SHR和WKY大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，AngⅡ使SHR大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞RhoGDIα表達(dá)上調(diào)，而L158809使其表達(dá)下調(diào)。據(jù)此推測(cè)，抑制AT1受體激活可降低RhoGDIα表達(dá)，而RhoA表達(dá)應(yīng)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗大鼠的冠狀動(dòng)脈RhoA蛋白表達(dá)水平下調(diào)與此研究結(jié)果一致。給予替米沙坦干預(yù)后，胰島素抵抗大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA蛋白表達(dá)水平降低被逆轉(zhuǎn)。

近期的研究顯示ROCK上調(diào)在人和動(dòng)物血管痙攣中發(fā)揮重要作用[8]。對(duì)心絞痛患者冠脈內(nèi)使用法舒地爾可以顯著抑制乙酰膽堿誘導(dǎo)的冠脈痙攣及其相關(guān)的心肌缺血,提示了Rho激酶很大程度上參與了冠脈痙攣的發(fā)病[12]。另外，法舒地爾在微血管心絞痛患者也有一定的治療效果，說(shuō)明Rho激酶參與介導(dǎo)了冠脈微血管的高反應(yīng)性[13]。AngⅡ刺激可使人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ROCK的功能和表達(dá)水平上調(diào)[14]。本研究中胰島素抵抗大鼠ROCK1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，但給予替米沙坦干預(yù)后RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達(dá)水平和ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與以上研究結(jié)果相類似。由于本研究未檢測(cè)RhoA和ROCK活性，對(duì)其功能變化尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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