汪蓓蕾 張 瑞 劉 妍 張金曉 郭 剛

近年來，國際腎臟病及急救醫(yī)學(xué)界趨向用急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）來取代傳統(tǒng)的急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）這一概念，以強(qiáng)調(diào)對(duì)尚未進(jìn)入腎衰竭階段的急性腎功能異?；颊哌M(jìn)行早期診斷和早期處理的重要性[1]。因此，選用易定量、高敏感性和可早期預(yù)測的腎損傷標(biāo)志物至關(guān)重要。腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，Kim-1）是一類Ⅰ型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括胞漿區(qū)和含有Ig樣結(jié)構(gòu)域及黏蛋白域的胞外區(qū)，可能參與了腎臟疾病的損傷及修復(fù)過程[2]。本研究通過對(duì)腎損傷模型中腎Kim-1基因和蛋白水平的研究，旨在為以尿Kim-1作為預(yù)測早期腎損傷的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 順鉑、慶大霉素（Sigma公司）；環(huán)孢素（諾華制藥）；Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶（Invitrogen公司）；DNA Marker DL-2000（精美生物工程公司）；SYBR green MIX（Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、二硫蘇糖醇（DTT）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（天津博美科生物技術(shù)有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程公司）；羊抗大鼠Kim-1多抗（R&D公司）；小鼠抗β-actin單抗、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（博奧森公司）；醋酸纖維素膜、ECL試劑盒（millipore公司）；Contifuge 17RS臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Heraeus公司）；GeneSnap凝膠圖像采集分析系統(tǒng)（SynGene公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀、垂直板電泳儀（Bio-Rad公司）。

1.2 動(dòng)物分組和造模 雄性SD大鼠36只，SPF級(jí)，10～12周，體質(zhì)量220～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)單位許可證編號(hào)：SCXK（京）2006-0009。試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水，進(jìn)食。SD大鼠按體質(zhì)量分層后隨機(jī)分為順鉑、慶大霉素、環(huán)孢素腎損傷組和各對(duì)照組，每組6只。

1.2.1 順鉑誘導(dǎo)腎損傷模型 順鉑腎損傷組腹腔注射順鉑7.5 mg/kg，給藥體積為5 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥6 d；對(duì)照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥6 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 慶大霉素腎損傷模型 慶大霉素腎損傷組腹腔注射慶大霉素120 mg/kg，給藥體積為2 mL/kg，連續(xù)給藥12 d，每日1次；對(duì)照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥12 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 環(huán)孢素腎損傷模型 環(huán)孢素腎損傷組1～22 d灌胃給環(huán)孢素30 mg/kg，23～43 d皮下注射給藥17.5 mg/kg，44～52 d皮下注射給藥30 mg/kg；對(duì)照組以相同方式給予生理鹽水。取給藥52 d后大鼠腎臟組織，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織病理學(xué)檢查 腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片（3 μm）后做常規(guī)HE染色。200或400倍光鏡下，觀察各組大鼠腎小管上皮組織形態(tài)的病理變化。腎小管病理變化由2個(gè)參數(shù)判定：（1）腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，小管擴(kuò)張。（2）腎小管嗜堿性變。每個(gè)參數(shù)按0～4分評(píng)定：0分，正常；1分，極輕度受損，病變范圍<25%；2分，輕度受損，病變范圍25%～50%；3分，中度受損，病變范圍51%～75%；4分，重度受損，病變范圍>75%。

1.4 RT-PCR檢測大鼠腎臟組織Kim-1基因的表達(dá)

1.4.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取大鼠腎臟組織100 mg，采用Trizol一步法進(jìn)行腎組織總RNA的提取。利用分光光度計(jì)測定總RNA的吸光度（A）值，根據(jù)A260/A280和A260/A230的比值鑒定總RNA純度。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性。各管分別加入2 μg總RNA樣品，寡核苷酸Oligo（dT）181 μL（1 g/L），10 mmol/L dNTPs 1 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）水補(bǔ)齊，總體積12 μL?；靹蚝?0 000 r/min瞬時(shí)離心5 s，65 ℃ 5 min后立即冰浴；加入5×Buffer 4 μL，0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）2 μL，RNA酶抑制劑1 μL（40 U），混勻，37 ℃ 2 min，立即冰浴，再加入M-MLV 1 μL（200 U），總體積20 μL。混勻，10 000 r/min瞬時(shí)離心5 s，37 ℃ 50 min，70℃15 min，-20℃保存。

1.4.2 RT-PCR檢測Kim-1及管家基因GAPDH的表達(dá)水平 各引物序列利用Gene Runner軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性序列。Kim-1引物：上游5′-AG TCACCTATCGGAGCAG-3′，下游5′-GAACCATCCAGGAATC TC-3′， 擴(kuò)增片段長度為135 bp；管家基因GAPDH：上游5′-A CAGCAACTCCCATTCTT-3′，下 游5′-TCCAGGGTTTCTTACT CC-3′，擴(kuò)增片段長度為160 bp。采用Takara公司的SYBR green PCR試劑盒，反應(yīng)體系：總體積20 μL，含SYBR green MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水 7.0 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃10 s、退火（Kim-l 58.1℃；GAPDH 56℃）10 s、72℃ 10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。通過測定PCR產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)累積量，獲得樣品的擴(kuò)增曲線。接著進(jìn)行熔解曲線分析：95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s，用待測樣品2-△CT值表示目的基因相對(duì)表達(dá)量[3（]CT是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)一定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；樣品△CT=目的基因CT值-GAPDH CT值）。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳鑒定，測序交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.5 Western Blot法檢測大鼠腎臟組織Kim-1蛋白

1.5.1 膜蛋白Kim-1的提取 取100 mg腎組織在600 μL RIPA裂解液[1×PBS，1%Nonidet P-40，0.5% 去氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）1 mmol/L，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）及蛋白酶抑制劑1 mmol/L苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），20 μmol/L亮肽酶素]中充分勻漿后，12 000 ×g離心15 min后收集上清液。取少量上清利用PIERCE公司BCATM蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 膜蛋白Kim-1的Western Blotting 以30 μg蛋白質(zhì)與2X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液1∶1混合，100℃變性10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后，將凝膠中的蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用適量的封閉液（5%脫脂奶粉溶于含0.05%Tween20的Tris-HCl緩沖鹽溶液TBS中），室溫震蕩1 h后4℃放置過夜。以wash buffer（含0.05%Tween20的TBS）清洗NC膜3次后將其置入一雜交袋中，加入封閉液稀釋的山羊抗大鼠Kim-1多抗（1∶400），4℃震搖過夜。NC膜經(jīng)wash buffer漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG二抗（1∶5 000）溶液，37℃震搖孵育1 h。最后用ECL法曝光顯影。DH-2000凝膠圖像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和數(shù)據(jù)處理。以β-actin作為內(nèi)參照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以±s表示。各實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)照組之間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)；不同實(shí)驗(yàn)組之間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟病理學(xué)改變 各藥物對(duì)照組的腎組織結(jié)構(gòu)均呈正常，見圖1a、c、e；順鉑腎損傷組腎臟皮髓交界處均出現(xiàn)不等程度腎小管擴(kuò)張，較多腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，基底膜裸露，腔內(nèi)有大量紅染無結(jié)構(gòu)的顆粒狀物質(zhì)，較多腎小管腔內(nèi)有蛋白管型，見圖1b，評(píng)分為3分。慶大霉素模型組大鼠腎小管擴(kuò)張，腎皮質(zhì)內(nèi)大量腎小管變性、壞死，較多腎小管中可見蛋白管型，見圖1d，評(píng)分為2.3分。環(huán)孢素模型組大鼠腎臟內(nèi)較多腎小管發(fā)生輕度嗜堿性變，見圖1f，評(píng)分為2分。鏡檢結(jié)果表明：由順鉑、慶大霉素及環(huán)孢素誘導(dǎo)的3個(gè)腎損傷模型均造模成功。

2.2 大鼠腎組織Kim-1及管家基因GAPDH RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 GAPDH、Kim-1 mRNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，分別在160 bp、135 bp處出現(xiàn)目的條帶，見圖2、3。同時(shí)，RT-PCR陰性對(duì)照（反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈時(shí)以水代替M-MLV）無擴(kuò)增產(chǎn)物，排除了所提取RNA中基因組DNA的存在，見圖2。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與預(yù)期相符。

2.3 Kim-1和GAPDH的擴(kuò)增曲線和熔解曲線 各組樣品的擴(kuò)增曲線呈明顯的S形，曲線拐點(diǎn)清楚，而且在平臺(tái)期幾乎重合，說明獲得的擴(kuò)增曲線良好。各熔解曲線未見雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，同時(shí)熔解峰（主峰）對(duì)應(yīng)的Tm（DNA的解鏈溫度）值與擴(kuò)增產(chǎn)物的理論Tm值相近，見圖4。

2.4 化學(xué)藥物誘導(dǎo)的腎損傷對(duì)腎組織中Kim-1 mRNA和蛋白水平的影響 各對(duì)照組腎Kim-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)腎損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。各模型組中均可檢測到腎Kim-1蛋白陽性表達(dá)，而對(duì)照組中均未檢測到，見圖5～7。順鉑組kim蛋白表達(dá)水平最高，慶大霉素組次之，環(huán)孢素組最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各組大鼠腎組織Kim-1 mRNA的表達(dá)水平（n=6，±s）

Table 1 Expression levels of Kim-1 mRNA of renal tissues between two groups表1 各組大鼠腎組織Kim-1 mRNA的表達(dá)水平（n=6，±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對(duì)照組腎損傷組t順鉑（4.45±1.08）×10-5（5.92±1.22）×10-2 7.465**慶大霉素（3.13±1.21）×10-4（8.39±2.65）×10-2 6.040**環(huán)孢素（2.29±1.21）×10-4（4.33±1.66）×10-3 2.656*

Figure 5 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between DDP-renal injury model group and control group圖5 順鉑誘導(dǎo)腎損傷模型組和對(duì)照組Kim-1蛋白Western bolt結(jié)果

Figure 6 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between GM-renal injury model group and control group圖6 慶大霉素誘導(dǎo)腎損傷模型組和對(duì)照組Kim-1蛋白Western bolt結(jié)果

Figure 7 Results of Kim-1 protein expression detected by Western blot between cyclosporine-renal injury model group and control group圖7 環(huán)孢素誘導(dǎo)腎損傷模型組和對(duì)照組Kim-1蛋白Western bolt結(jié)果

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各組大鼠腎組織Kim-1蛋白的表達(dá)水平（n=6，±s）

Table 2 Expression levels Kim-1 protein of renal tissues between two groups表2 各組大鼠腎組織Kim-1蛋白的表達(dá)水平（n=6，±s）

**P<0.01

組別 Kim-1/β-actin 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P順鉑組（1）慶大霉素組（2）環(huán)孢素組（3）F 28.557±11.122 8.779±0.997 0.770±0.168 29.522**<0.001<0.001 0.048組比（1）∶（2）（1）∶（3）（2）∶（3）

3 討論

Kim-1在正常腎臟內(nèi)微量表達(dá)，而在腎缺血或腎毒性急性損傷后會(huì)出現(xiàn)顯著變化：去分化近端小管細(xì)胞（proximal tubular cells，PTC）內(nèi)Kim-l基因轉(zhuǎn)錄水平急劇上調(diào)，Kim-l蛋白也隨之大量表達(dá)，而隨著結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)，Kim-1這種高表達(dá)的現(xiàn)象也會(huì)消失[1]。除AKI外，慢性的腎損傷過程，如蛋白負(fù)荷腎病[4]和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎病[5]也會(huì)導(dǎo)致腎近端小管上Kim-1表達(dá)量增高。目前，對(duì)腎損傷時(shí)高表達(dá)Kim-1所發(fā)揮的具體功能還不清楚。Ichimura等[6]發(fā)現(xiàn)，AKI時(shí)Kim-1在吞噬凋亡細(xì)胞的過程中起到重要作用。這也證實(shí)了Kim-1作為一種磷脂酰絲氨酸受體可以誘導(dǎo)對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬作用的研究[7]。另外，尿中Kim-1在雙側(cè)腎缺血10 min后的第1天就可發(fā)生顯著性增高[8]，在急性腎小管壞死（acute tubule necrosis，ATN）時(shí)尿Kim-l能在鏡下發(fā)現(xiàn)任何管型之前被檢出，且可持續(xù)到恢復(fù)階段；而在糖尿病腎病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎病患者中，尿Kim-l在出現(xiàn)明顯尿蛋白后也不會(huì)增加[9]。因此，尿Kim-l可成為檢測早期腎損傷的可靠生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究選用3種作用機(jī)制不同但都有明確腎毒性的化學(xué)藥物建立大鼠AKI模型。順鉑引起腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)漿網(wǎng)鈣泵的控制受干擾、細(xì)胞核內(nèi)糖體蛋白質(zhì)的合成受抑制、溶酶體功能抑制及細(xì)胞內(nèi)凝血等[9]；慶大霉素通過膜蛋白受體GP330（glycoprotein 330）介導(dǎo)的陽離子蛋白或受體內(nèi)吞飲作用進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，形成的囊泡與初級(jí)溶酶體結(jié)合，使溶酶體膜通透性增加，以致酶大量漏出，繼而損害線粒體等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)[10]；環(huán)孢素誘導(dǎo)的腎毒性過程與前列腺素（PG）代謝失衡、腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、內(nèi)皮素（ET）生成過多、一氧化氮（NO）量不足、反應(yīng)性氧代謝產(chǎn)物（ROM）增加和腎臟抗氧化能力下降等因素有關(guān)[11]。在本研究中，3種藥物都導(dǎo)致了大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞不同程度的變性、壞死，同時(shí)，腎Kim-1 mRNA和蛋白含量也都發(fā)生了顯著升高。順鉑組腎Kim-1在基因轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組有約1 000倍的增高；慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷也造成了腎組織內(nèi)的Kim-1 mRNA升高約260倍；環(huán)孢素腎毒性模型盡管在病理學(xué)上表現(xiàn)為較多腎小管輕度嗜堿性變，但其腎Kim-1基因轉(zhuǎn)錄水平增高了近19倍。由此可見，雖然3個(gè)模型的腎小管急性損傷由不同的機(jī)制導(dǎo)致，但是3個(gè)模型腎Kim-1 mRNA水平的增高程度隨病理學(xué)病變?cè)u(píng)分高低有相同的變化趨勢，且3組模型腎Kim-1蛋白表達(dá)水平亦然。

3種腎毒性藥物除了導(dǎo)致腎Kim-1 mRNA水平和蛋白含量顯著升高。Van等還發(fā)現(xiàn)尿中Kim-1含量與受損腎單元Kim-1蛋白表達(dá)量之間存在相關(guān)性的結(jié)論[4]；而有關(guān)Kim-1蛋白的細(xì)胞外域在基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）作用下裂解為可溶性片段而釋放到細(xì)胞外并排入尿中的發(fā)現(xiàn)[12]，則說明了腎毒性藥物誘導(dǎo)腎損傷時(shí)腎Kim-1的高表達(dá)與尿Kim-1含量升高之間的因果關(guān)系。

總之，本研究利用順鉑等化學(xué)藥物造成了大鼠腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死等急性病變，并且從分子水平和蛋白水平檢測到腎Kim-1高表達(dá)，證明了由順鉑等化學(xué)藥物誘導(dǎo)的大鼠AKI與腎Kim-1高表達(dá)之間的存在直接相關(guān)性，并解釋了腎損傷模型中尿Kim-1含量增高的原因，為將尿Kim-1作為早期預(yù)測腎小管損傷的無創(chuàng)性生物指標(biāo)提供了一定參考。

Figure 1 Histopathological examination of renal tissues(HE staining)圖1 腎組織病理學(xué)檢查（HE染色）

Figure 2 Product of GAPDH RT-PCR and negative control of 2%agarose gel electrophoresis圖2 GAPDH RT-PCR產(chǎn)物和陰性對(duì)照2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure 3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of Kim-1圖3 Kim-1 RT-PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳

Figure 4 Amplification and melting curves of Kim-1 and GAPDH圖4 Kim-1和GAPDH的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

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