陳 晨，張洪峰，王 樂，魏亞超，李 倩

（邯鄲市中心醫(yī)院藥劑科，河北邯鄲 056001）

光譜法研究順鉑與溶菌酶的相互作用

陳 晨＊，張洪峰，王 樂，魏亞超，李 倩

（邯鄲市中心醫(yī)院藥劑科，河北邯鄲 056001）

目的：研究順鉑與溶菌酶相互作用的光譜學特征。方法：應用光譜法研究順鉑與溶菌酶的相互作用機制；計算其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和結(jié)合距離；根據(jù)熱力學參數(shù)判斷作用力類型；考察二者的相互作用對溶菌酶構(gòu)象的影響。結(jié)果：順鉑對溶菌酶的熒光淬滅過程為生成復合物的靜態(tài)淬滅；供能體與受能體之間的距離小于7 nm，發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移；二者以氫鍵和范德華力結(jié)合為主；同步熒光光譜和三維熒光光譜表明結(jié)合反應影響了氨基酸殘基所處的微環(huán)境。結(jié)論：順鉑能與溶菌酶結(jié)合并改變?nèi)芫傅臉?gòu)象。

順鉑；溶菌酶；熒光光譜法；紫外-可見光譜法；熒光淬滅

溶菌酶（Lysozyme，LYSO）是一種小分子堿性蛋白質(zhì)，普遍存在于鳥類、家禽的蛋清和哺乳動物的眼淚、唾液、血液、尿液、乳汁和組織細胞中[1]，能夠和許多外源和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合，運載多種藥物。順鉑（Cisplatin）為細胞周期非特異性藥物，具有細胞毒性，可抑制癌細胞的脫氧核糖核酸（DNA）復制過程，并損傷其細胞膜結(jié)構(gòu)，有較強的廣譜抗癌作用，臨床上用于治療卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肺癌等[2]；其副作用常常是限制該藥劑量的重要因素，包括胃腸道反應、骨髓抑制、腎臟毒性和神經(jīng)毒性等[3]。為了使抗癌藥物能定位于腫瘤組織釋放而減少對正常組織的毒副反應，選擇蛋白質(zhì)為藥物載體的應用日益廣泛[4，5]。作為生物體內(nèi)重要的非特異性體液免疫因子，LYSO具有抗菌抗病毒、抗腫瘤、增強免疫力等多種藥理作用[6]，與抗腫瘤藥物聯(lián)用，可能會增強其靶向性及抗癌療效。筆者采用熒光光譜法和紫外-可見光譜法研究了順鉑與LYSO的相互作用，建立結(jié)合的體外模型，探討結(jié)合的緊密程度、結(jié)合模式、結(jié)合部位等問題，所得結(jié)果將為藥物的聯(lián)用以及抗腫瘤藥物靶向載體的選擇提供有利的信息。

1 材料

1.1 儀器

LS-50B型熒光光譜儀（英國珀金-埃爾默公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；PHSJ-5實驗室pH計（上海精密科學儀器有限公司）；CU600電熱恒溫水浴箱（上海益恒實驗儀器有限公司）。

1.2 試藥

0.05 mol·L－1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）緩沖溶液（內(nèi)含0.1 mol·L－1氯化鈉，pH＝7.4）；LYSO（國藥集團化學試劑有限公司，濃度：1×10－5mol·L－1，批號：F20080526）、順鉑（昆明貴研藥業(yè)有限公司，含量：1×10－3mol·L－1，批號：320080410，避光保存）均用上述緩沖溶液配制；其余試劑均為分析純，試驗用水為雙重蒸餾水。

2 方法

2.1 熒光光譜法

在一系列10 mL容量瓶中，加入1×10－5mol·L－1LYSO溶液1 mL和不同量（0、10、20、30、40、50、60μL）的1.0×10－3mol·L－1順鉑溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，搖勻、靜置。

熒光發(fā)射光譜：準確移取3 mL含有不同濃度順鉑的LYSO溶液于石英比色皿中，在298 K和310 K條件下，分別掃描其熒光發(fā)射光譜。以280 nm為激發(fā)波長（λex），激發(fā)和發(fā)射狹縫均為7 nm，掃描范圍為300～420 nm。

同步熒光光譜：Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm，掃描范圍分別為270～310 nm和250～315 nm。

三維熒光光譜：發(fā)射波長（λem）250～420 nm，激發(fā)波長（λex）200～330 nm，掃描次數(shù)14次，步長10 nm，狹縫均為7 nm。

2.2 紫外-可見光譜法

掃描300～420 nm波長范圍內(nèi)，1.0×10－6mol·L－1順鉑溶液的紫外吸收光譜。

3 結(jié)果

3.1 熒光光譜特征

LYSO是由129個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)，Trp62和Trp108是LYSO熒光的主要來源[7]。圖1是含有不同濃度順鉑的LYSO溶液的熒光發(fā)射光譜，從圖中可以看出，隨著順鉑濃度的增加，LYSO在343 nm處的熒光發(fā)射峰強度逐漸降低，且峰位置發(fā)生了一定程度的藍移，表明順鉑與LYSO發(fā)生了相互作用，LYSO的內(nèi)源性熒光產(chǎn)生淬滅。順鉑與LYSO相互作用的熒光淬滅圖見圖1（圖中，c（LYSO）＝1.0×10－6mol·L－1，曲線1→7 c順鉑分別為（0、1、2、3、4、5、6）×10－6mol·L－1）。

圖1 順鉑與LYSO相互作用的熒光淬滅圖Fig 1 Fluorescence quenching spectra of interaction between cisplatin and LYSO

3.2 光淬滅機制的判斷

熒光淬滅本質(zhì)上就是與發(fā)光過程相互競爭而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程，根據(jù)淬滅機制不同分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，分別遵循Stern-Volmer方程（見式1）和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程（見式2）：

式中F0為未加入淬滅劑時LYSO的熒光強度；F為加入淬滅劑后LYSO的熒光強度；Kq為雙分子淬滅過程的速率常數(shù)；τ0為不存在淬滅劑時熒光分子的平均壽命；KSV是動態(tài)淬滅常數(shù)；KLB是靜態(tài)淬滅常數(shù)；[Q]為淬滅劑的濃度。

以F0/F對[Q]作圖，得到不同溫度下的KSV（表1）。動態(tài)淬滅主要依賴于分子擴散，溫度越高，擴散系數(shù)越大，淬滅常數(shù)隨著溫度的升高而升高；相反，對于靜態(tài)淬滅，溫度越高，基態(tài)絡合物的穩(wěn)定性越差，淬滅常數(shù)越小[8]。從表中看出隨著溫度的升高，Ksv減小，可初步判斷淬滅過程為靜態(tài)淬滅。同時，各類淬滅劑對生物大分子的擴散碰撞淬滅常數(shù)最大不超過2×1010L·mol－1·s－1[9]，而試驗所得Kq均遠大于此值，進一步證明順鉑與LYSO之間主要發(fā)生了靜態(tài)淬滅反應。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程得到KLB（表1）。

表1 不同溫度下的K sv和K LBTab 1 K sv and K LB at different temperatures

3.3 表觀結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）

藥物與蛋白質(zhì)的相互作用一般采用位點結(jié)合模型來描述，根據(jù)結(jié)合和自由的分子建立化學平衡方程：lg[（F0－F）/F]＝lg Ka+n lg[Q][3]，得出Ka和n，見表2。結(jié)果，298 K和310 K時，順鉑與LYSO的n均接近于1，表明二者近似以1∶1結(jié)合生成復合物。

3.4 輻射能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?ster’s能量轉(zhuǎn)移原理，如果供能體能夠發(fā)熒光，其熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊，并且供能體與受能體的最大距離小于7 nm，就可認為供能體與受能體之間發(fā)生了非能量輻射轉(zhuǎn)移，導致供能體熒光淬滅。臨界能量轉(zhuǎn)移距離（R0）、結(jié)合距離（r）及能量轉(zhuǎn)移效率（E）符合以下關(guān)系[10]：

表2 不同溫度下的K a和nTab 2 Binding constants（K a）and binding sites（n）at different temperatures

F（λ）為供能體在波長λ處的熒光強度，ε（λ）為受能體在λ處的摩爾吸光系數(shù)，J是供能體熒光發(fā)射光譜與受能體紫外吸收光譜的重疊積分。偶極空間取向因子K2＝2/3，LYSO中色氨酸殘基的量子產(chǎn)率Φ＝0.15，介質(zhì)折射指數(shù)n＝1.36。計算得出r＝3.83 nm，小于7 nm。由此推斷順鉑與LYSO之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，促使了LYSO的熒光淬滅。順鉑的紫外吸收光譜與LYSO熒光發(fā)射光譜疊加圖，見圖2（圖中，c（KYSO））＝c順鉑＝1.0×10－6mol·L－1）。

圖2 順鉑的吸收光譜與LYSO的熒光發(fā)射光譜疊加圖Fig 2 Overlap of the absorption spectrum of cisplatin with thefluorescencespectrum of LYSO

3.5 作用力類型的確定

有機小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的作用力類型主要有疏水作用力、靜電引力、氫鍵和范德華力等。當ΔH＞0，ΔS＞0時，分子間的作用力主要是疏水作用力；當ΔH＜0，ΔS＜0時，主要為氫鍵和范德華力；當ΔH＜0，ΔS＞0時，靜電引力占主導[11]。當溫度變化范圍不大時，反應焓變ΔH和熵變ΔS可以近似看作常數(shù)。根據(jù)熱力學方程：

求得不同溫度下的熱力學參數(shù)，見表3。

表3 不同溫度下順鉑與LYSO作用的熱力學參數(shù)Tab 3 Thermodynamic parameters of the reaction betweencisplatin and LYSO at different temperatures

可以看出，ΔG均小于0，即在298 K和310 K時順鉑與LYSO的相互作用過程都是自發(fā)進行的。ΔH＜0，ΔS＜0，說明順鉑與LYSO之間主要以氫鍵和范德華力相結(jié)合。

3.6 同步熒光光譜

固定激發(fā)波長與發(fā)射波長的間距Δλ，同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器即得同步熒光光譜。通過選擇合適的波長差可將普通熒光光譜上相互重疊的熒光峰分開，Δλ＝15 nm和Δλ＝60 nm分別體現(xiàn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征。氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與所處環(huán)境極性密切相關(guān)[12]，根據(jù)最大熒光發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。順鉑與LYSO相互作用的同步熒光光譜見圖3（圖中，溫度為298 K，cLYSO＝1×10－6mol·L－1；曲線1→7 c順鉑依次為（0、1、2、3、4、5、6）×10－6mol·L－1）。

圖3 順鉑與LYSO相互作用的同步熒光光譜A.Δλ＝15 nm；B.Δλ＝60 nmFig 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between cisplatin and LYSOA.Δλ＝15 nm；B.Δλ＝60 nm

由圖3可以看出，隨著順鉑濃度的增大，LYSO色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰均產(chǎn)生藍移，說明微環(huán)境的疏水性增加，肽鏈的伸展程度可能有所減弱，氨基酸殘基處于更“包埋”的狀態(tài)中[13]，從而引起了LYSO構(gòu)象的變化。

3.7 三維熒光光譜

研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)-藥物小分子相互作用中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化時，三維熒光光譜能提供比常規(guī)熒光光譜更完整的光譜信息，是一種有價值的光譜指紋技術(shù)。圖4為LYSO及順鉑與LYSO的三維投影和等高線光譜圖（圖中，溫度為298 K，cLYSO＝1×10－6mol·L－1；曲線1→7 c順鉑依次為（0、1、2、3、4、5、6）×10－6mol·L－1）。峰1為瑞利散射峰（λex＝λem），峰2為LYSO的熒光發(fā)射峰。LYSO空白溶液的峰2（λex/λem，F(xiàn)）為（280/344 nm，912）；順鉑與LYSO相互作用后，熒光發(fā)射峰強度降低，等高線的疏密程度也發(fā)生改變，峰2為（280/342 nm，786），峰強度降低了126，峰位置藍移了2 nm，說明結(jié)合反應使體系微環(huán)境的疏水性增強、極性降低，所得結(jié)果與同步熒光光譜一致。由此推斷結(jié)合部位可能處于LYSO的疏水腔中，順鉑的引入導致疏水腔極性的改變，進而使LYSO的構(gòu)象發(fā)生變化[14]。

圖4 LYSO空白及順鉑與LYSO相互作用后的三維熒光投影和等高線光譜圖Fig 4 Three-dimensional fluorescence spectra and contour spectra of LYSO and cisplatin-LYSO

4 討論

LYSO是一種天然的、無毒、無副作用的蛋白質(zhì)，順鉑能與其以氫鍵和范德華力結(jié)合生成復合物。選擇LYSO作為順鉑的靶向載體，可能會減小其對正常組織的毒副作用，增強抗腫瘤療效。同時，二者的結(jié)合常數(shù)較小，表明結(jié)合程度不是很大，順鉑較容易分布到靶組織并代謝。

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Spectroscopic Study on the Interaction of Cisplatin with Lysozyme

CHEN Chen，ZHANG Hong-feng，WANG Le，WEI Ya-chao，LI Qian
（Dept.of Pharmacy，Handan Central Hospital，Hebei Handan 056001，China）

OBJECTIVE：To study the spectroscopic characteristics of the interaction between cisplatin and lysozyme.METHODS：The interaction mechanism of cisplatin with lysozyme was investigated by spectroscopic method；the binding constants，binding sites and binding distance were calculated；the interaction force was estimated by thermodynamic parameters；the effects of their interactin on conformation change of lysozyme were investigated.RESULTS：The fluorescence quenching mechanism of cisplatin with lysozyme was due to the formation of cisplatin-lysozyme complex which resulted in static quenching procedure.The distance between donor and acceptor was less than 7 nm，which indicated that the energy nonradiative transfer occurred.Hydrogen bonds and van der Waals forces played a major role in the binding action.Synchronous and three-dimensional fluorescence spectra revealed that the interaction of cisplatin and lysozyme influenced the environments of amide acid residues.CONCLUSION：Cisplatin could bind with lysozyme and change the conformation of lysozyme.

Cisplatin；Lysozyme；Fluorescence spectrometry；UV-visible spectrum；Fluorescence quenching

R969.1；R979.1

A

1001-0408（2012）30-2847-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.30.25

＊藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：0310-2118084。E-mail：1388097@163.com

2011-08-21

2012-05-14）