陳大福 陳梅強 李江紅 梁 勤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂的腸道內(nèi)棲息著相當(dāng)數(shù)量的微生物類群。這些微生物對于蜜蜂的營養(yǎng)和代謝起著重要的作用。根據(jù)微生物與蜜蜂的關(guān)系可將其大致分為兩類：病原微生物和共生菌。蜜蜂腸道內(nèi)存在一定量的病原微生物，其中細菌性病原菌主要包括擬幼蟲芽孢桿菌、蜂房球菌、尤瑞狄斯桿菌、糞鏈球菌、蜂房芽孢桿菌、敗血病桿菌、塵埃芽孢桿菌等。其中對于引起美洲幼蟲腐臭病的擬幼蟲芽孢桿菌和引起歐洲幼蟲腐臭病的蜂房球菌的研究報道最多。2006年，戎映君等分離了一種新的蜜蜂細菌性幼蟲病病原菌，經(jīng)分離鑒定此致病菌為腸球菌屬的屎腸球菌[1]。蜜蜂與微生物的共生是一種普遍存在的現(xiàn)象，許多共生菌對蜜蜂的生長、發(fā)育起著重要作用。蜜蜂與其他昆蟲抵御疾病可能是通過與其共生的微生物的屏蔽效應(yīng)。Evans & Armstrong的研究表明，某些共生菌對蜜蜂主要病原細菌擬幼蟲芽孢桿菌具有抑制效應(yīng)，并且共生菌可能對普遍的病原體有自然的拮抗作用[2]。

細菌的16S rRNA因其編碼基因集“保守、變異”于一身，作為生物系統(tǒng)指標(biāo)最為合適[3]。不同種細菌基因序列的比較研究表明，16S rRNA基因在同種細菌間高度保守，因此，在細菌“種”水平的鑒定上，16S rRNA基因的全序列分析可作為“金標(biāo)準”[4，5]。16S rRNA基因保守性又是相對的，在保守區(qū)間存在著9或10個變異區(qū)，不同細菌屬、種間有不同程度的差異。因此，可利用保守區(qū)序列設(shè)計細菌通用引物將細菌16S rRNA片斷擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定[6]。

本研究通過用含氯霉素的LB培養(yǎng)基篩選和分離蜜蜂中腸中的細菌，并運用PCR的方法體外擴增并克隆該細菌的16S核糖體RNA基因的片段序列，通過比對序列對細菌進行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）采自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場；菌株是從意大利蜜蜂成年工蜂中腸中篩選分離培養(yǎng)所得。

1.2 方法

1.2.1 蜜蜂中腸細菌的篩選分離

制作若干含終濃度為20 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基，取成年蜜蜂中腸的內(nèi)容物，搗碎加適當(dāng)?shù)臏缇♂寯噭?，均勻涂布在培養(yǎng)基上，挑取菌斑，提取細菌基因組DNA。

1.2.2 細菌的裂解

用滅菌移液槍的槍頭挑取單個菌斑，加入到含有200 μl細菌裂解液和1 μl蛋白酶K的離心管中，用震蕩器將之混勻，置PCR儀中裂解反應(yīng)。反應(yīng)程序：65 ℃溫育30 min，98 ℃裂解20 min，裂解反應(yīng)結(jié)束后12000 rpm離心5 min取上清液6μl做PCR反應(yīng)模板。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成

在GenBank中檢索出多種細菌的16 S rRNA基因序列，通過Blast軟件在線進行同源性比較，在16S rRNA基因序列的保守序列區(qū)間設(shè)計通用引物。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.4 細菌16s rRNA基因片段的克隆

1.2.4.1 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

（1）反應(yīng)體系：模板DNA（細菌裂解液）6 μl，10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs 4 μl，引物F、R各2 μl，Taq酶2μl，補ddH2O至50 μl。

（2）反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性45 s、52 ℃退火合成105 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

1.2.4.216s rRNA基因片段的克隆與測序

本研究采用低熔點瓊脂糖凝膠法，用DNA快速純化回收試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）純化回收PCR產(chǎn)物。利用pGEM-T Easy Vector SystemⅠ試劑盒（Promega）進行載體連接與轉(zhuǎn)化，用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校ū本┒⑸锛夹g(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進行酶切鑒定。一般反應(yīng)體系為：EcoRⅠ1 μl，10×Buffer 2 μl，質(zhì)粒DNA 3 μl（≤1 μg），滅菌水補至20 μl。37℃溫浴反應(yīng)2～3 h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，能切出相應(yīng)片段的即為陽性。將鑒定為陽性克隆的菌液，委托生工生物工程有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的設(shè)計與合成

利用Primer-BLAST軟件在線與細菌的16S rRNA基因片段序列進行多重比對分析各序列的保守區(qū)和變異區(qū)，設(shè)計并合成細菌16S rRNA基因片段序列的通用引物：

F：5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'R：5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

2.2 細菌16s rRNA基因片段序列的克隆

2.2.1 PCR擴增與產(chǎn)物回收

用設(shè)計的通用引物分別對DNA樣品進行PCR擴增，使用DNA快速純化/回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，溶解于20μl的TE溶液中。取5μl回收的產(chǎn)物經(jīng)1.5 %（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳，可見到1500bp左右的單一條帶非常清晰，說明回收得率較高（圖1）。

2.2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將重組質(zhì)粒DNA和原空載體質(zhì)粒DNA分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進行酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。空載體質(zhì)粒DNA經(jīng)酶切后，僅產(chǎn)生2000bp以上的單一條帶。而重組質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物中產(chǎn)生大小為750bp左右2個片段，該2個片段大小之和與1500bp左右的PCR產(chǎn)物基本相等（圖2），酶切產(chǎn)生2個片段可能是PCR產(chǎn)物片段內(nèi)部還有一個EcoRⅠ位點。因此，該重組質(zhì)粒即可鑒定為陽性克隆。

圖1 細菌DNA的PCR產(chǎn)物純化回收凝膠電泳圖譜

2.3 16S rRNA基因片段的序列分析

將鑒定為陽性的克隆C3委托上海生工生物工程公司進行測序。測序結(jié)果表明所克隆的16S rRNA基因片段為1506 bp的DNA片斷（圖3）。使用RESEARCH軟件查找結(jié)果如預(yù)計一樣在第666位有一個EcoRI酶切位點，經(jīng)EcoRI酶切為665bp和835bp的2個片段。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定

圖3 細菌16S rRNA基因片段序列

2.4 耐氯霉素細菌菌株的鑒定

將所測得序列與NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank收錄細菌16S rRNA基因序列進行比對。結(jié)果可以搜索到大量細菌的16S rRNA基因片段序列與所測得細菌的序列有較高的相似度（圖4）。該序列與GQ259887序列吻合度100 %，證明該序列為克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的特有序列，說明從蜜蜂中腸中培養(yǎng)分離出的耐氯霉素細菌菌株為克雷伯氏菌。

圖4 所測細菌的16S rRNA基因片段序列與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

4 討論

（1）細菌16S rRNA鑒定方法作為分子生物學(xué)快速發(fā)展的產(chǎn)物，與傳統(tǒng)的診斷方法相比，準確性和靈敏度均有了較大的提高。由于l6S rRNA序列的保守性和存在的普遍性，以及核酸序列本身的穩(wěn)定性，序列分析的重現(xiàn)性極高，基于當(dāng)今分析技術(shù)的改進，應(yīng)用16S rRNA作為分子指標(biāo)，可以實現(xiàn)快速、微量、準確簡便的對微生物進行分類鑒定。

（2）本研究從蜜蜂中腸分離出的耐氯霉素菌株經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌?？死撞暇鸀槟c桿菌科中一類有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，對外界抵抗力強對多數(shù)抗生素易產(chǎn)生耐藥性。與腸桿菌科其他細菌一樣，具菌體抗原和莢膜抗原。克雷伯氏菌廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及水、土壤和谷物中[7]。Singh等[8]于1992年在魚、蝦、蟹等水產(chǎn)類食品中檢測到肺炎克雷伯菌，但未對其致病性展開研究。還有一些學(xué)者先后在患病石龜、中華鱉（Trionyx sinensis）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）中分離到該菌[9，10]；在蜜蜂體內(nèi)尚屬首次發(fā)現(xiàn)該菌。一般情況下克雷伯氏菌不致病，因為它是一種條件致病菌，對畜禽危害不大，發(fā)病與寄主防御功能缺陷及誘發(fā)因素有關(guān)。目前尚未發(fā)現(xiàn)有克雷伯氏菌引起的蜜蜂疾病，但不排除有和其他細菌共同作用引起蜜蜂疾病的可能性。

（3）本研究結(jié)果證明在蜜蜂腸道中存在某些耐藥性的菌株。這一現(xiàn)象很可能是在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過程中給蜂群防病、治病而長期、頻繁使用抗生素造成的。蜂群用藥過程中所使用的抗生素對蜜蜂腸道細菌，無論是共生菌還是病原菌均產(chǎn)生影響，長此以往，蜜蜂腸道細菌都會對所使用的抗生素產(chǎn)生一定程度的耐藥性。因此，在蜂群中不科學(xué)使用抗生素，不僅會使蜜蜂病原菌產(chǎn)生耐藥性，影響防治效果，還會對蜂產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生嚴重影響。這就要求在養(yǎng)蜂生產(chǎn)過程中謹慎用藥，避免大劑量使用，長期使用，以延緩病原菌耐藥性的產(chǎn)生。

[1]戎映君, 蘇松坤等.一種新的蜜蜂細菌性幼蟲病病原菌的分離鑒定.微生物學(xué)報, 2006, 46(6): 994-998.

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