李洪鵬，白旭東，高杰，巴方，劉寧

脊髓損傷后神經(jīng)再生和功能修復(fù)是當今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一大難題。脊髓損傷后，損傷周邊反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增殖并分泌硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)[1-2]，CSPGs的糖鏈可以明顯抑制軸突再生，而硫酸軟骨素酶ABC可以通過降解其糖鏈而促進中樞神經(jīng)的再生，進而促進大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的修復(fù)，提高肢體的運動功能[3-4]。本實驗通過制作Wistar大鼠T10脊髓損傷模型，探討硫酸軟骨素酶ABC對脊髓損傷后肢功能的恢復(fù)及肌肉組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 硫酸軟骨素酶ChABC：美國SIGMA公司；GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒：邁新公司。成年Wistar大鼠40只，雄性，清潔級，體重250~300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。

1.2 動物模型制作 6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg)，背部剃毛，常規(guī)消毒，以第8~10胸椎棘突為中心行背部正中切口，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉，暴露棘突及椎板，顯微咬骨鉗咬除第8~10胸椎棘突和椎板，暴露脊髓，約長4~5 mm，在T10節(jié)段將脊髓右側(cè)半橫斷。以大鼠的健側(cè)下肢作為對照組(A組)，患側(cè)下肢隨機分為單純脊髓損傷組(B組，n=20)及術(shù)后注射硫酸軟骨素酶ABC組(C組，n=20)。B組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.1 mol/L PBS 3μl；C組在脊髓橫斷后，向脊髓損傷處注入0.5 U/μl硫酸軟骨素酶ABC 3μl?？p合傷口，術(shù)后每天2次給予青霉素2×105U肌肉注射，并按摩膀胱直至排尿反射建立。動物飼養(yǎng)室溫維持在25℃~30℃。

1.3 后肢運動功能評分 各組大鼠分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d和28 d(各5只)采用BBB評分法進行后肢運動功能評分：將動物置于面積1 m2的平面場地，自由活動4 min，由2名熟悉BBB評分標準的非本組實驗人員觀察，記錄動物后肢運動情況，取平均值。

1.4 取材與標本制作 各組大鼠分別于BBB評分后取材。6%水合氯醛6 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg)，生理鹽水及4%多聚甲醛300 ml灌注固定30 min，游離并切取大鼠腓腸肌。4%多聚甲醛固定12 h，放入30%蔗糖磷酸緩沖液1~2 d，OTC包埋后在-20℃恒溫箱內(nèi)行冠狀連續(xù)冰凍切片。切片厚10 μm。

1.5 AChE染色 應(yīng)用GENMED冰凍切片乙酰膽堿酯酶活性染色試劑盒對標本進行染色：冰凍切片用清理液略洗，加工作液，入37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，避免光照，再用清理液清洗1次，GENMED蘇木素復(fù)染試劑盒-GMS80067進行復(fù)染，中性樹脂封片，即刻在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 AchE活性分析 應(yīng)用MetaMorph/OP10/BX41圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析AchE染色陽性光密度值(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分 所有動物在術(shù)前評分均為21分；術(shù)后即刻各組動物健側(cè)運動功能短暫降低后，很快恢復(fù)到21分，患側(cè)損傷后BBB評分為0。B組和C組均與A組有顯著性差異(P<0.01)。隨著時間的延長，B組與C組大鼠的BBB評分有增高的趨勢，總的評分有非常高度顯著性差異(F=531.275,P=0.000)。術(shù)后14 d、28 d，C組BBB評分均優(yōu)于B組(P<0.05)。見表1。

2.2 腓腸肌內(nèi)AChE的表達 各組大鼠健側(cè)腓腸肌運動終板區(qū)AchE為棕黑色、細顆粒狀亞鐵氰化銅沉淀，在冠狀切面上呈橢圓形或卵圓形，大小20~40μm，邊緣清晰(圖1)。而B組(圖2)和C組(圖3)腓腸肌運動終板區(qū)AchE陽性顆粒形狀多不規(guī)則，且面積較小，尤以7 d、14 d、28 d下降顯著。

圖像分析顯示：A組(健側(cè))各時間段AChE的OD值無顯著性差異。而B組及C組OD值在損傷后與健側(cè)比較均明顯下降(P<0.01)，以B組下降更明顯。C組在損傷后14 d及28 d較B組有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組術(shù)后不同時間AChE的平均光密度

3 討論

脊髓損傷的病理生理機制非常復(fù)雜，近年來對脊髓損傷后微環(huán)境中的抑制因子研究較多。CSPGs在中樞神經(jīng)發(fā)育過程中可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞增生、遷徙、分化，軸突的生長和路徑選擇，以及突觸的形成和成熟[4]。脊髓損傷后，CSPGs的堆積可抑制神經(jīng)細胞軸突的再生修復(fù)[5]。CSPGs是帶有多種糖鏈的蛋白聚糖，而對神經(jīng)再生起抑制作用的主要因素是其糖鏈，因此本研究采用可以消化CSPGs葡胺聚糖鏈的ChABC。

BBB評分是由Basso等提出的一種脊髓運動功能評定法，用于評價大鼠脊髓損傷后肢體運動功能的恢復(fù)情況[6]。該評分標準包括許多動物行為細節(jié)和特征說明，分級較細致(0~21分)，評分與脊髓功能恢復(fù)有良好的一致性。

AChE主要存在于突觸間隙及運動終板，它可催化乙酰膽堿，使其水解為膽堿和乙酸。各種形式的AChE都能在脊髓運動神經(jīng)元和骨骼肌細胞中找到[7]。AChE活性不僅可反映運動神經(jīng)元的功能狀態(tài)[8]，而且終板區(qū)AChE對于神經(jīng)肌肉接頭突觸功能和結(jié)構(gòu)的維持也是必需的，所以終板區(qū)AChE含量能夠反映終板退變及再生情況[9-10]。

本研究顯示，脊髓損傷后，大鼠運動功能的恢復(fù)與乙酰膽堿酯酶表達一致，提示ChABC治療可以提高脊髓損傷后大鼠的后肢功能恢復(fù)，其機制可能是促進神經(jīng)再生并修復(fù)運動終板。

ChABC治療不僅可以促進脊髓本身的神經(jīng)再生和修復(fù)，阻止神經(jīng)肌肉接頭以上的退行性改變，而且可以加強肌肉與脊髓神經(jīng)的聯(lián)系，使遠端肢體進行形態(tài)與功能重塑。但ChABC裂解CSPGs促進神經(jīng)再生的機制目前仍然未完全清楚。

目前還沒有一種方法能夠使脊髓損傷完全康復(fù)，脊髓損傷治療的研究不應(yīng)只局限于損傷局部神經(jīng)再生，更要重視遠端肌肉組織內(nèi)運動終板的研究。綜合應(yīng)用多種治療方法對恢復(fù)運動功能具有廣大的研究前景和應(yīng)用價值。

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