何斌，吳鴻浩，呂金如，孫昊，吳昊，蔣雷，王淦楠，胡德亮，張勁松，陳彥

腦缺血卒中是臨床常見的高危疾病，涉及多種病理生理機制，其中氧化應(yīng)激是引發(fā)神經(jīng)元死亡級聯(lián)反應(yīng)的主要原因之一。體外研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元缺糖缺氧再灌注損傷后，過氧化物大量生成，谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量減少，以及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GPx)活性降低，體內(nèi)氧化及抗氧化系統(tǒng)平衡破壞，進而引發(fā)神經(jīng)元死亡級聯(lián)反應(yīng)[1]。人參皂甙Rg1是人參活性成分中已提純的重要單體活性成分，對缺血腦組織具有保護作用[2]。另有體外實驗表明，人參皂甙Rg1可通過抗氧化反應(yīng)，發(fā)揮抗衰老、保護帕金森病黑質(zhì)神經(jīng)元等藥理作用[3-4]。本實驗旨在海馬神經(jīng)元缺糖氧/復(fù)糖氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD-R)模型基礎(chǔ)上，探討人參皂甙Rg1對腦缺血后抗氧化能力的影響及其機制，提供人參皂甙Rg1腦保護作用和腦缺血病理機制方面的研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生24 h內(nèi)SD乳大鼠，雌雄不限，SPF級，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試劑與配液 人參皂甙Rg1(中國藥科大學(xué)分離純化)；GSH、GPx測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；多聚賴氨酸、谷氨酰胺、胰酶(SIGMA公司)；馬血清、DMEM、Neurabasal、B27(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；其余為國產(chǎn)分析純。

解剖液：NaC1(124 mmol/L)、KC1(5 mmol/L)、CaCl2(2.4 mmol/L)、 MgSO4(1.3 mmol/L)、 NaH2PO4(1.25 mmol/L)、NaHCO3(26 mmol/L)和 D-Glucose(10 mmol/L)，調(diào)節(jié)pH至7.4；培養(yǎng)液：80%高糖型DMEM(含Glu 4.5 g/L)、10%馬血清、10%胎牛血清、谷氨酰胺100μg/ml、青鏈霉素100 U/ml；培養(yǎng)液：98%Neurabasal培養(yǎng)基、2%B27無血清培養(yǎng)添加劑。

1.3 海馬神經(jīng)元無血清培養(yǎng) 取新生24 h內(nèi)的乳大鼠，消毒，分離出海馬組織，在預(yù)冷解剖液中剔除其血管、結(jié)締組織等，清洗、剪成約1×1×1 mm小塊。將其轉(zhuǎn)入含解剖液2 ml的離心管中，加入0.25%胰酶2 ml(終濃度是0.125%)，混勻，37℃消化20 min。加入4 ml預(yù)冷種植培養(yǎng)液中止消化，用細口吸管吹打20下左右，過200目不銹鋼網(wǎng)篩，1000 r/min離心10 min，棄上清液，加入4 ml種植培養(yǎng)液重懸細胞，吹打，過200目不銹鋼網(wǎng)篩，收集細胞懸液。取細胞懸液0.1 ml以臺盼蘭拒染法進行活細胞計數(shù)，以2×105~5×105/ml的密度接種于多聚賴氨酸包被過的直徑35 mm培養(yǎng)皿和96孔板中，貼壁2 h后每孔加種植培養(yǎng)液1 ml或0.1 ml。置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換為無血清培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換一半培養(yǎng)液。

1.4 海馬神經(jīng)元OGD-R模型制備 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)8~10 d，隨機分為正常對照組、模型組、人參皂甙Rg1干預(yù)組(低、中、高劑量組)。將模型組及人參皂甙Rg1干預(yù)組培養(yǎng)液換為低糖型DMEM(含葡萄糖≤1 g/L)，后者于缺糖缺氧前30 min加入人參皂甙Rg1 5μmol/L、20μmol/L、60μmol/L。兩組神經(jīng)元放置在密閉缺氧盒中，充入5%CO2氮氣，流速約2 L/min，并置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2.5 h。復(fù)糖氧時將培養(yǎng)液重新?lián)Q為高糖含氧的DMEM，在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h或24 h。正常對照組僅將培養(yǎng)液更換為高糖型DMEM，其余條件不變。

1.5 GSH、GPx測定 于再灌注6 h中止培養(yǎng)，用細胞刮刀收集細胞，PBS洗滌細胞1次，后用裂解液裂解細胞，4℃、12000 r/min離心10 min取上清，按試劑盒說明檢測GSH、GPx。

1.6 海馬神經(jīng)元細胞凋亡檢測 按照Hoechst熒光染色試劑盒要求操作，于再灌注24 h時吸出細胞培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液4℃過夜，去固定液，加0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，每次隨機計數(shù)3個視野內(nèi)200個細胞，計陽性凋亡細胞百分率。

1.7 四甲基偶氮唑鹽(MTT)代謝率測定 再灌注24 h時，于96孔培養(yǎng)板每孔加入MTT磷酸緩沖液20μl，至濃度0.5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除上清液，每孔加入二四基亞砜100μl，溶解生成的深藍色結(jié)晶，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用One-wayANOVA，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下，剛接種的海馬神經(jīng)元為圓形，體積小，胞體透亮，光暈明顯；2 h后細胞開始貼壁；24 h后活性好的細胞全部貼壁，神經(jīng)元長出短小的突起，周圍見扁平狀多邊形的神經(jīng)膠質(zhì)細胞；3~4 d后大多數(shù)膠質(zhì)細胞死亡，處于底層，上層的神經(jīng)元大多呈梭形、錐形、少數(shù)呈多邊形，體積明顯增大，突起增多、伸長；培養(yǎng)至8~10 d，神經(jīng)元胞體飽滿，軸突成熟，交織成網(wǎng)狀，可進行試驗，見圖1。

2.2 海馬神經(jīng)元GSH含量 再灌注后6 h，模型組和人參皂甙Rg1各劑量組海馬神經(jīng)元GSH較正常對照組降低(P<0.05)；人參皂甙Rg1中、高劑量組神經(jīng)元GSH含量顯著高于模型組(P<0.001)，而低劑量組與模型組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 海馬神經(jīng)元GPx活性 再灌注后6 h，模型組和人參皂甙Rg1各劑量組GPx活性均顯著低于正常對照組(P<0.001)；人參皂甙Rg1中、高劑量組神經(jīng)元GPx活性顯著高于模型組(P<0.001)，而低劑量組與模型組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.4 海馬神經(jīng)元凋亡率 經(jīng)Hoechst染色后，熒光顯微鏡下凋亡細胞胞核濃縮，較正常細胞核明亮，見圖2~圖6。復(fù)糖氧24 h后，各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較見表1。模型組及人參皂甙Rg1各劑量組神經(jīng)元凋亡率顯著高于正常對照組(P<0.001)；人參皂甙Rg1中、高劑量組凋亡率較模型組顯著減少(P<0.001)，而人參皂甙Rg1低劑量組較之無顯著性差異。人參皂甙Rg1三劑量組之間凋亡率比較，中、高劑量組間無顯著性差異(P>0.05)，但均較低劑量組顯著減少(P<0.001)。見表1。

2.5 海馬神經(jīng)元存活率 應(yīng)用MTT測定復(fù)糖氧24 h后神經(jīng)元存活率。模型組及人參皂甙Rg1各劑量組神經(jīng)元存活率顯著低于正常對照組(P<0.001)；人參皂甙Rg1中、高劑量組存活率較模型組顯著升高(P<0.001)，而人參皂甙Rg1低劑量組較之無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組6 h后GSH含量、GPx活性及24 h后海馬神經(jīng)元凋亡率、存活率比較

3 討論

發(fā)生腦缺血/再灌注時，受損腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species)，如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫(H2O2)等，大量活性氧可與細胞脂質(zhì)、蛋白及核酸發(fā)生反應(yīng)，造成細胞死亡/凋亡。機體可通過一系列抗氧化酶及抗氧化分子清除ROS：超氧化物歧化酶將超氧陰離子歧化為H2O2，H2O2進一步由GPx、過氧化氫酶清除。目前認(rèn)為，GPx是神經(jīng)元清除H2O2的主要過氧化物酶，該過程以GSH為底物。GSH在腦組織中含量豐富，在體大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，GSH缺失可加重腦缺血/再灌注腦損傷，而給予GSH類似物或GSH前體物可明顯減輕損傷[5]。其可能的機制為，GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑，可清除過量的氧應(yīng)激產(chǎn)物，并且能與蛋白質(zhì)形成二硫化物，后者被稱為蛋白質(zhì)谷胱甘肽化，谷胱甘肽化的蛋白質(zhì)可降低神經(jīng)元氧應(yīng)激損傷[6]。此外，GSH還是調(diào)節(jié)氧化-還原轉(zhuǎn)化的信號分子，GSH的缺失可導(dǎo)致Fos過表達，進而引起神經(jīng)元凋亡[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，再灌注后6 h GSH含量、GPx活性較高的神經(jīng)元，其后受到的損傷較小，與以上觀點一致。

人參是祖國傳統(tǒng)中藥資源中應(yīng)用最為廣泛的藥物之一，人參皂甙Rg1是人參活性成分中已提純的重要單體活性成分，已發(fā)現(xiàn)具有抗疲勞、抗衰老、抗癌、降血脂、增強記憶力、提高免疫力等藥理作用。近幾年人們發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg1可以經(jīng)減少谷氨酸釋放、抑制凋亡、營養(yǎng)神經(jīng)等作用[8-10]，對抗腦缺血損傷。另有在體實驗發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1具有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的功能，保護缺血再灌注的心、腎器官減輕損傷，并在抗衰老、保護帕金森病黑質(zhì)神經(jīng)元等方面發(fā)揮作用[3-4,11-12]。本實驗通過離體細胞模型發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1減少脫糖氧再灌注神經(jīng)元GSH、GPx的缺失，在腦缺血時也可發(fā)揮抗氧化作用，對抗腦缺血損傷。不過目前人參皂甙Rg1對缺糖氧神經(jīng)元抗氧化作用的報道較少，其具體的作用機制尚需進一步研究明確。人參皂甙Rg1對腦缺血的保護作用可能涉及多項機制，根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為人參皂甙Rg1可減輕缺糖氧神經(jīng)元抗氧化成分的缺失，該機制可能在腦保護過程中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起重要作用。本實驗經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1可對抗腦缺血時的氧化損傷，保護腦組織，其機制可能與人參皂甙Rg1減輕GSH缺失、提高GPx活性有關(guān)。本實驗結(jié)果豐富了人參皂甙Rg1的腦保護研究，但其具體作用機制還有待于進一步闡明。

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