張榮建，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院，衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，北京 100050)

猴腺病毒(simian adenovirus，SAdV)，是靈長類動物呼吸道和消化道的常見病毒之一，可引起肺炎、咽炎、腸胃炎、結(jié)膜炎等，以糞口途徑傳播為主，主要感染獼猴、非洲綠猴、黑猩猩和狒狒等［1］。SAdV為線性雙鏈DNA病毒，屬腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬。Esona等人發(fā)現(xiàn)SAdV在外觀無異常的實驗猴群中高度流行且感染株系呈廣泛的基因多樣性［2］，并存在變種傳染給人的風(fēng)險［3，4］，也有報道稱在生產(chǎn)用猴腎細(xì)胞和脊灰減毒疫苗檢定中分離出一些 SAdV 毒株［5］。

目前國內(nèi)關(guān)于SAdV感染流行情況的研究很少，現(xiàn)有檢測方法如病毒分離培養(yǎng)等周期長、特異性較差。我們建立的PCR方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測猴群中 SAdV的感染情況，并且靈敏度較高。本方法只需一步PCR就可以將SAdV與鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)、禽腺病毒(CELO)區(qū)分開來，并且能檢出不同亞屬的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)。

1 材料和方法

1.1 樣品與毒株來源

65份食蟹猴和恒河猴糞便樣本采集自國家藥物安全評價中心和協(xié)爾鑫生物資源研究所。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生產(chǎn)的五批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫(批號分別為:990420A，990422A，990423A，990428A，990505A)和北京天壇生物生產(chǎn)的一批脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(批號:20091106)。BSC-1細(xì)胞，本實驗室保存;陽性對照SAdV-1(VR-195TM)、SAdV-3(VR-1449TM)、SAdV-20(VR-541TM)購自美國 ATCC;鼠腺病毒(MAD)、禽腺病毒(CELO)、犬腺病毒(ICH)均本實驗室保存。

1.2 試劑及儀器

胎牛血清購自杭州四季青公司;PCR熱啟動反應(yīng)體系、DL1500 DNA marker、基因組DNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;PCR反應(yīng)用引物均由上海生工合成;DNA膠回收試劑盒購自杭州Axygen公司。糞便基因組DNA快速提取試劑盒購自北京Abigen公司;日立 CP70ME低溫超速離心機。質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(Axygen)購自經(jīng)科宏達(dá)公司。

2 實驗方法

2.1 靶基因的選擇及引物設(shè)計

用Vector NTI多序列比對分析已報道的不同亞屬 SAdV和 MAD、ICH、CELO基因組序列，選擇SAdV保守性高且與 MAD、ICH、CELO序列有差異區(qū)域hexon基因和 pol基因部分序列作為靶序列。針對該區(qū)域用Primer Premier 5.0設(shè)計五組引物并合成。同時，與文獻(xiàn)報道的引物進(jìn)行比較。

五組引物(1，2，4，5，6)及文獻(xiàn)引物(3)的序列見表1:

2.2 SAdV病毒基因組DNA提取

SAdV病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)凍融3次后10 000 r/min離心5 min，收集上清液。

口服糖丸疫苗先用1 mL PBS溶解。培養(yǎng)液上清、疫苗溶劑和液態(tài)疫苗按照基因組DNA提取試劑盒的說明書提取 DNA，400 μL樣品提取 20 μL DNA，－20℃保存。

2.3 PCR反應(yīng)

2.3.1 PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)體系總體積 25 μL，其中引物體積 0.5 μL(1 μM)，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL(1 U)，10× PCR uffer 2.5 不 μL，dNTP mixture(2.5 mM each)2 μL，dd H2O 17.3 μL，待檢樣品DNA模板2 μL。反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性5 min;95℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35 個循環(huán);72℃再延伸7 min。

2.3.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化:引物濃度選取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L 等 5 個梯度，退火溫度選取 60℃、59.5℃、58.6℃、57.2℃、55.5℃、54.3℃、53.5℃、53.0℃等8個梯度，Taq酶的量選取0.5 U、1 U、1.5 U、2 U 等 4 個梯度，循環(huán)數(shù)選擇 20、25、30、40等4個梯度。

擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳鑒定。

表1 SAdV PCR引物序列Tab．1 Sequences of the SAdV primers

表2 PCR條件優(yōu)化結(jié)果Tab．2 Optimization results of the PCR assay

2.4 特異性鑒定

2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定:取禽腺病毒(CELO)、鼠腺病毒(MAD)、犬腺病毒(ICH)及正常BSC-1細(xì)胞培養(yǎng)液。用前述SAdV病毒基因組提取方法提取DNA，分別以這四種DNA為模板，以設(shè)計的五組引物及文獻(xiàn)報道的引物在優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.4.2 測序鑒定:利用 DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，通過初步酶切鑒定，選擇陽性克隆送上海生工公司測序。

2.4.3 敏感性的測定:將起始濃度為 47.90 μg/mL的 SAdV DNA樣本做倍比稀釋，分設(shè) 10－1～10－9九個濃度梯度，使用上述6對引物進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.5 PCR檢測方法的初步應(yīng)用

2.5.1 實驗猴群糞便樣本的檢測:采集單籠飼養(yǎng)的食蟹猴和恒河猴糞便樣本65份，糞便樣本核酸的提取按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行。用特異性與敏感性最佳的PCR方法對糞便樣本核酸進(jìn)行檢測，擴增產(chǎn)物按上述方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠鑒定和測序鑒定。

序列用Bioedit軟件編輯，不同株系的HAdV和SAdV hexon基因序列引自 Genbank。利用 MEGA4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析，基于引物之間的序列用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹。

2.5.2 動物源性生物制品的檢測:取六批口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫，分別按前述SAdV病毒基因組提取方法提取DNA。選擇特異性與敏感性最佳的PCR方法進(jìn)行檢測，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。

3 結(jié)果

3.1 PCR反應(yīng)及條件優(yōu)化結(jié)果

選取SAdV-1的陽性對照按將各個因素分別進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按電泳條帶選取最佳反應(yīng)條件。各個引物PCR反應(yīng)優(yōu)化結(jié)果如表2所示。優(yōu)化條件后各個引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1，圖2所示。

圖1 引物1、2 PCR反應(yīng)優(yōu)化后結(jié)果Fig．1 Optimization results of PCR with the primer 1，2．

3.2 PCR方法特異性驗證

3.2.1 瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定:五組引物在以SAdV為模板時均有明顯目的條帶出現(xiàn)，陰性對照BSC-1細(xì)胞均無目的條帶。引物1中ICH有微弱擴增，引物 2中 CELO、ICH、MAD均有擴增，見圖 3。引物3(文獻(xiàn)引物)PCR特異性檢驗結(jié)果顯示G亞屬、A亞屬和 F亞屬的 SAdV-1、SAdV-3和 SAdV-20均有明顯的目的條帶出現(xiàn)，說明此PCR方法檢測譜系廣，不同亞屬的猴腺病毒均能檢出，但 ICH和MAD也有微弱條帶出現(xiàn)表明此方法特異性不是很好，見圖 4。引物 4中只有 SAdV-1、SAdV-3和SAdV-20有明顯的目的條帶出現(xiàn)，ICH、MAD、CELO均無目的條帶，見圖5，說明檢測譜系廣且特異性好。引物5中只有SAdV-1有明顯目的條帶出現(xiàn)，ICH、MAD、CELO均無目的條帶，說明第五組引物有較好的特異性，見圖6。

圖2 引物3、4、5、6 PCR反應(yīng)優(yōu)化后結(jié)果Fig．2 Optimization results of PCR with the primer 3，4，5，6．

圖3 引物1、2特異性檢測Fig．3 Specificity test for the primer 1，2．

與文獻(xiàn)引物相比，引物1、4、5均有較好的特異性，結(jié)果見圖 3，4，6，8。

3.2.2 測序鑒定:將陽性擴增片斷進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果用 BLAST與 NCBI中 SAdV-1序列比對，核苷酸符合率達(dá)99%(325/328)，證明是要擴增的SAdV-1目的片段，說明該法特異性好。

3.2.3 敏感性鑒定:PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳顯示引物3(文獻(xiàn)引物)能檢測到的SAdV模板最高稀釋度為10－4，所能檢測到的最小基因組濃度是4.79 ng/mL。而設(shè)計的1、2、4、5組引物能檢測到的最高稀釋度分別為:10－4、10－5、10－6、10－3。引物 4的靈敏性為文獻(xiàn)引物的100倍。

圖5 引物4特異性驗證Fig．5 Specificity test for the primer 4．

六組引物不同的PCR檢測方法經(jīng)特異性和敏感性鑒定可看出，引物4進(jìn)行的PCR檢測方法的特異性、靈敏度最佳，檢測譜系廣，不同亞屬的猴腺病毒均能檢出，適合作為檢測猴腺病毒的分子生物學(xué)方法。

3.2.4 檢測方法的初步應(yīng)用:

3.2.4.1猴糞便樣本的 PCR檢測:經(jīng) PCR檢測，其中有15份食蟹猴樣本和17份恒河猴樣本出現(xiàn)328 bp的目的條帶，呈 SAdV陽性。我國實驗猴群中SAdV感染流行情況見表3，食蟹猴感染率高于恒河猴為57.7%，廣東地區(qū)感染率為60%，高于其它三個地區(qū)。

圖6 引物5特異性驗證Fig．6 Specificity test for the primer 5．

3.2.4.2 SAdV陽性樣本的測序鑒定:選取23份SAdV陽性樣本測序，并將序列與 NCBI收錄的SAdV序列進(jìn)行比對，同源性為91% ～100%。證明了檢測方法的準(zhǔn)確性，同時也說明建立的PCR方法能夠同時檢測出不同型別的SAdV。

3.2.4.3 SAdV系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹構(gòu)建:如圖7所示，系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生分析表明實驗猴群中感染的SAdV型別呈廣泛的基因多樣性，主要分為3個大基因簇，其中最大一簇與HAdV-G亞屬腺病毒進(jìn)化距離很近，屬于 HAdV-G亞屬如17M．f等;另一簇與其它亞屬相比，與HAdV-G亞屬進(jìn)化距離較近，但與上一簇是明顯兩個分支如11M．f，與 G亞屬的SAdV-7序列同源性為91%。最后一簇與新發(fā)現(xiàn)的SAdV-49和SAdV-50株系接近如 xie32M．m，這一基因簇還沒有命名且與其它亞屬進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，是否代表新的SAdV亞屬還需進(jìn)一步詳細(xì)研究。

3.4.2.4 猴源性生物制品的檢測:

脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗分別提取DNA，經(jīng)PCR檢測，均未檢出SAdV核酸序列，見圖8。

4 分析與討論

PCR方法由于其安全、簡便快速的特點被廣泛應(yīng)用。SAdV基因組全長約34 000 bp，G+C含量為55.2%［5］，hexon基因和 pol基因部分序列進(jìn)化上高度保守是PCR引物設(shè)計的靶序列，也常用于系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析［6］。最近，Esona 等［7］人針對 hexon 基因設(shè)計了一對簡并引物建立了SAdV PCR檢測方法并對廣州地區(qū)猴群進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)SAdV高度流行且感染株系呈廣泛的基因多樣性。經(jīng)特異性驗證該PCR檢測方法特異性較差，不能將SAdV與犬腺病毒(ICH)和鼠腺病毒(MAD)區(qū)分開來。

本實驗成功篩選出一對特異性好、靈敏度更高的引物，目的條帶大小為328 bp，測序結(jié)果與NCBI發(fā)表的SAdV-1序列同源性為99%。對引物濃度、Taq酶用量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳PCR反應(yīng)條件，建立了 SAdV的 PCR檢測方法。本方法只需一步PCR就可以將SAdV與MAD、ICH、CELO區(qū)分開來，并且能檢出不同亞屬的猴腺病毒(SAdV-1、SAdV-3、SAdV-20)，所能檢測到的最小DNA模板濃度為47.9 pg/mL，比文獻(xiàn)引物靈敏度提高100倍。

Roy的研究表明SAdV可能感染猴小腸上皮細(xì)胞，造成SAdV慢性感染并由腸道持續(xù)向外排毒，糞便中檢出率高［8］。用建立的 PCR檢測方法調(diào)查SAdV的感染流行情況，發(fā)現(xiàn)我國實驗猴群中SAdV高度流行且呈現(xiàn)出廣泛的基因多樣性，與Esona等人報道一致。

由于SAdV經(jīng)常呈慢性持續(xù)感染狀態(tài)［9］，且在外觀無異常的恒河猴和食蟹猴種群中高度流行，最早發(fā)現(xiàn)的幾株猴腺病毒如 SAdV-1、SAdV-3等是從脊灰疫苗生產(chǎn)和檢定過程中分離，因此，需要加強對實驗猴群和猴源性生物材料以及相關(guān)生物制品中SAdV的檢測，避免人類感染SAdV的潛在風(fēng)險。用建立的PCR法對猴源性生物制品進(jìn)行檢測，未檢測到SAdV核酸序列，初步說明目前猴源性生物制品污染SAdV的幾率較小，生產(chǎn)和檢定過程中質(zhì)量控制很嚴(yán)格。

表3 PCR方法調(diào)查獼猴糞便樣本中SAdV的感染流行情況Tab．3 The epidemiological study of SAdV infection detected in rhesus monkey feces by PCR

圖7 Mega軟件比對人腺病毒和猴腺病毒六鄰體基因一段序列(286 bp)建立進(jìn)化樹 (HAdV、SAdV序列來自GenBank中，M．m代表恒河猴，M．f代表食蟹猴)Fig．7 Generation of an evolutionary tree by comparing the sequences(286 bp)of a fragment of hexon gene of human and monkey adenoviruses using Mega software．Root in GenBank;M．m represents rhesus;M．f represents Macaca fascicularis．

圖8 猴源性生物制品的檢測Fig．8 Detection of SAdV in monkey-origin biological products．

我們所建立的檢測SAdV核酸的PCR方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可實際應(yīng)用于監(jiān)測猴群SAdV感染，通過隔離持續(xù)向外排毒個體，切斷糞口途徑，可以有效避免SAdV在猴群中的傳播，也適用于猴源性生物制品SAdV污染的檢測，對于建立高質(zhì)量的實驗猴群和保證猴源性生物制品安全意義重大。

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