王靜，李響，解端陽，陳艷，蔣曉燕

TNFRSF11B基因是腫瘤壞死因子受體超家族的一個(gè)成員，其基因產(chǎn)物為骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)，具有抑制破骨細(xì)胞形成、分化、存活并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的功能，是體內(nèi)成骨細(xì)胞骨形成與破骨細(xì)胞骨吸收動(dòng)態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)因子。有研究顯示，TNFRSF11B基因的遺傳變異與骨密度和骨質(zhì)疏松癥骨折密切相關(guān)[1-3]。既往研究表明，適當(dāng)?shù)捏w重對人體骨密度有正性作用，而骨的負(fù)荷主要來源于肌肉的主動(dòng)收縮[4]；也有研究者認(rèn)為，肌肉質(zhì)量與骨密度關(guān)系顯著[5]。那么與骨密度密切相關(guān)的TNFRSF11B基因的遺傳變異是否與肌肉量相關(guān)呢？本研究旨在探索TNFRSF11B基因8個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagging single nucleotide polymorphism,tSNP)對人體不同部位肌肉量水平的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)收集2006年1～12月濟(jì)南市婦幼保健院健康志愿者419人。所有個(gè)體均為濟(jì)南市常住漢族居民，其中男性203人，女性216人；年齡18～74歲，平均(49±12)歲。排除有慢性疾病或正在服藥者。所有受試者均簽署知情同意書[6]。

1.2 肌肉量測定 采用GE公司(原LUNAR公司)DPX2NT雙能X線骨密度儀測量全身各部位肌肉量。測定時(shí)要求受檢者只穿貼身衣褲，不佩戴任何含金屬的物件；整個(gè)測定過程由3名專職工作人員負(fù)責(zé)操作；儀器由微機(jī)控制，自動(dòng)分析打印結(jié)果。每日測量前均進(jìn)行校準(zhǔn)和儀器質(zhì)量控制，CV＜0.5%。

1.3 單核苷酸多態(tài)性選擇 采用tSNP策略。TNFRSF11B基因tSNP選擇和基因分型數(shù)據(jù)來自人類基因庫(http://www.hapmap.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap 27_B36/)中的漢族人群。所有tSNP以LD相關(guān)系數(shù)r2=0.8，最小等位基因頻率(MAF)＞5%為選擇標(biāo)準(zhǔn)，選出TNFRSF11B基因8個(gè)tSNP位點(diǎn)。

1.4 單核苷酸多態(tài)性檢測 所有研究對象抽取外周血3 ml，2%依地酸二鈉(EDTA)抗凝，置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存。采用酚-氯仿法抽提基因組DNA，定量標(biāo)化至10 ng/ml，應(yīng)用ABI 7900HT基因分型平臺(tái)及相應(yīng)軟件(ABI，F(xiàn)oster City，CA)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(±s)表示；不同基因型組之間的全身各部位肌肉量的比較采用方差分析(ANOVA)；協(xié)方差分析校正性別和年齡的影響；顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

所有對象全部進(jìn)入分析，無脫落。各部位肌肉量見表1。TNFRSF11B基因的8個(gè)tSNP位點(diǎn)是rs2875845、 rs1485288、 rs11573869、 rs3102727、rs3102728、 rs11573849、 rs3134062、 rs1385503。 利用Taqman基因分型技術(shù)對樣本進(jìn)行基因分型，基因分型的成功率分別為97.9%、99.0%、97.9%、97.4%、99.8%、98.6%、98.3%、98.8%。基因型在濟(jì)南漢族人群的分布符合Hardy-Weinberg平衡。各基因位點(diǎn)的基因型頻率見表2。

SNP rs2875845位點(diǎn)AA、AG、GG基因型攜帶者個(gè)體左右上肢、下肢、軀干等部位肌肉量及總肌肉量依次增加(P＜0.05)。見表3。SNP rs1485288位點(diǎn) CC、CT、TT基因型攜帶者個(gè)體的軀干肌肉量及總肌肉量依次增加(P＜0.05)。見表4。在校正了年齡與性別后仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他位點(diǎn)與全身各部分肌肉量未見顯著性差異。

表1 各部位肌肉量(g)

表2 TNFRSF11B基因tSNP基因型頻率和特性

表3 TNFRSF11B基因rs2875845位點(diǎn)多態(tài)下各部位肌肉量(g)

表4 TNFRSF11B基因rs1485288位點(diǎn)多態(tài)下各部位肌肉量(g)

3 討論

人類TNFRSF11B基因位于染色體8q24，長度為28587 bp，包括5個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。我們選擇的8個(gè)tSNP都位于第1內(nèi)含子。TNFRSF11B基因第1內(nèi)含子占基因全長的66.3%。到目前為止，此基因中被研究的大多數(shù)SNP集中于啟動(dòng)子區(qū)、第1外顯子及第1內(nèi)含子區(qū)域。我們首次在濟(jì)南漢族人中發(fā)現(xiàn)，TNFRSF11B基因第1內(nèi)含子的rs2875845和rs1485288多態(tài)同中國漢族人的肌肉量相關(guān)。隨著rs2875845和rs1485288位點(diǎn)G、T等位基因拷貝數(shù)增加，肌肉量也隨之增加。

骨保護(hù)素參與骨密度改變的基本過程。成骨細(xì)胞系細(xì)胞分泌骨保護(hù)素，與核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)競爭性結(jié)合，促進(jìn)了RANKL與RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性[7]。骨保護(hù)素可通過腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)在腫瘤疾病中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而提高結(jié)腸癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤患者的存活率。血清骨保護(hù)素還影響著冠心病和外周血管病的嚴(yán)重程度[8-9]。TNFRSF11B的遺傳變異影響著復(fù)雜性狀多基因遺傳疾病的發(fā)生。

肌肉量一方面受氧耗和代謝的影響，另一方面亦與許多激素有關(guān)，如脂肪組織分泌的瘦素、雌激素、脂聯(lián)素；消化道分泌的胃饑餓素刺激生長激素；胰腺分泌的胰島素等[10]。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，體重指數(shù)的增加同骨密度增加成正相關(guān)[11]。在以肌肉量增加為主的肥胖相關(guān)性研究顯示，肌肉組織比脂肪組織對骨密度的變化影響更大[12]。

本組研究對象均是生活在濟(jì)南的漢族人，生活方式等環(huán)境因素較類似，同質(zhì)性較好，所以我們沒有將營養(yǎng)、生活習(xí)慣、地理環(huán)境等環(huán)境因素作為混雜因素來處理。為增加人群的代表性，我們檢查了不同年齡的成年人樣本，而且在募集志愿者時(shí)，盡可能通過多個(gè)渠道，以增加對總體的代表性。在肌肉量的測量上，我們采用國際通用的雙能X射線骨密度儀，嚴(yán)格按程序測量，并加強(qiáng)質(zhì)控，盡可能減少信息偏倚。

目前研究肌肉量的遺傳因素報(bào)道較少，既往研究顯示睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子基因、肌肉生長抑制素基因、Ⅰ型膠原α1基因、維生素D受體基因、胰島素樣生長因子基因的遺傳變異影響與肌肉相關(guān)的表型[13-16]。我們的研究旨在探索TNFRSF11B基因8個(gè)tSNP是否影響人體不同部位肌肉量的水平。TNFRSF11B基因tSNP中的rs2875845和rs1485288位點(diǎn)在中國漢族人中處在不同的單倍型區(qū)域。rs2875845代表7個(gè)SNP位點(diǎn) ： rs1994276、 rs11573838、 rs10505346、rs10955911、rs11573896、rs1994276、rs1485287；而rs1485288位點(diǎn)僅代表它自己，可能在Hapmap數(shù)據(jù)庫中，與它連鎖的變異位點(diǎn)還沒有被檢測到。

本組人群中，SNP rs2875845和SNP rs1485288的LDs很弱，說明這兩個(gè)位點(diǎn)可能都僅代表著不同致病位點(diǎn)的遺傳標(biāo)志物。同rs2875845位點(diǎn)強(qiáng)連鎖的rs10505346位點(diǎn)為一個(gè)功能性致病位點(diǎn)，與術(shù)前前列腺特異性抗原(preoperative prostate-specific antigen,PSA)水平相關(guān)，可能是影響前列腺癌根治術(shù)后是否復(fù)發(fā)的一個(gè)預(yù)后因素[17]。但它們自身與各種多基因復(fù)雜疾病的關(guān)系研究未見報(bào)道，它們的功能也不得而知。一般而言，第1內(nèi)含子的變異較其他部位內(nèi)含子變異更有可能是功能變異。位于結(jié)構(gòu)基因第1內(nèi)含子的SNP可能促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄[18-19]，從而導(dǎo)致不同等位基因?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控不同。

TNFRSF11基因多態(tài)性與肌肉量表型的關(guān)聯(lián)研究國內(nèi)外均未見報(bào)道。我們的研究僅提示其中兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(rs2875845和rs1485288)可能是影響肌肉量水平的一個(gè)因素。鑒于TNFRSF11基因參與眾多疾病病理生理的過程，而肌肉量與運(yùn)動(dòng)、骨密度、肥胖等密切而復(fù)雜的關(guān)系，其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。且不同人群有不同的遺傳結(jié)構(gòu)，故我們的結(jié)果需要在不同人群中進(jìn)一步重復(fù)驗(yàn)證。

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