劉若杉，孫莉

嗎啡作為經(jīng)典的阿片類藥物，是治療中、重度疼痛最常用、最為有效的鎮(zhèn)痛藥物。但實(shí)際臨床應(yīng)用中，長期、大劑量使用該藥常出現(xiàn)嗎啡耐受現(xiàn)象，藥物鎮(zhèn)痛作用逐漸減退甚至消失，還可出現(xiàn)嚴(yán)重的痛覺過敏，明顯降低疼痛治療效果，在很大程度上限制了嗎啡的臨床應(yīng)用。

δ受體是慢性嗎啡耐受形成的重要分子基礎(chǔ)，在此過程中其表達(dá)明顯減少[1]，而β-arrestin 1作為參與阿片受體脫敏與內(nèi)吞的可溶性蛋白，主要介導(dǎo)δ受體脫敏與內(nèi)吞。研究證實(shí)，小劑量芬太尼可延緩大鼠慢性嗎啡耐受的出現(xiàn)，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討[2]。本研究擬觀察不同劑量芬太尼對(duì)慢性嗎啡耐受大鼠藍(lán)斑核δ受體與β-arrestin 1表達(dá)的可能影響，初步探討其延緩慢性嗎啡耐受發(fā)生的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 成年雄性SD大鼠40只，體重(230±20)g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；硫酸嗎啡注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：080513)；枸櫞酸芬太尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：071106)；δ受體多克隆抗體(Chemicon公司，美國)；β-arrestin 1多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)；RT-PCR試劑盒(Takara公司，日本)；ZH-LUO/B鼠尾測(cè)痛儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥方法 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于22℃、12 h/12 h晝夜照明的環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行痛閾篩選，排除痛反應(yīng)時(shí)間超過(xˉ±3SD)的大鼠。動(dòng)物隨機(jī)分為5組(n=8)：對(duì)照組(NS組)：注射生理鹽水1 ml/kg 2次，間隔30 min；慢性嗎啡耐受組(M組)：注射嗎啡10 mg/kg，30min后給予生理鹽水1 ml/kg；MF1、MF2、MF3組：?jiǎn)岱扔盟巹┝客琈組，給藥30 min后分別給予芬太尼3 μg/kg、6 μg/kg、12 μg/kg。采用頸部皮下注射給藥，每天給藥2次(8∶00、16∶00)，連續(xù)9 d。

1.3 熱輻射甩尾法痛閾行為學(xué)測(cè)試 每天于上午注射給藥后30 min測(cè)定大鼠痛閾。將大鼠置于固定器內(nèi)，待其安靜后將鼠尾放置于測(cè)痛儀的凹槽中，開啟50 W鹵素?zé)?，照射鼠尾中?/3處，記錄從熱源啟動(dòng)到大鼠甩尾的時(shí)間作為甩尾反應(yīng)的潛伏期(TFL閾值)。分別測(cè)量3次，每次間隔5 min，取其平均值作為痛閾值。設(shè)定終止時(shí)間為12 s，以防大鼠尾部皮膚損傷。

1.4 δ受體與β-arrestin 1 mRNA表達(dá)的測(cè)定 全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于第9天測(cè)痛閾值后，快速斷頭處死，取藍(lán)斑核部位腦組織。按照Trizol試劑說明書提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，取2 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，制備cDNA。β-actin、δ受體、β-arrestin 1的特異性PCR引物如下：β-actin上游引物為 5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′， 下 游 引 物 為5′-ATCATGTTTGAGACC-TTCAACA-3′；δ受體上游引物為 5′GCATCTGGG TCTTGGCTTCA3′，下游引物為 5′GGCTGCGGTCCTTCTCCTT3′；β-arrestin 1 上游引物為 5′CGCCAACCGTGA-AATCCT3′，下游引物為5′CCATCATCCTCTTCGTCCT3′。

1.5 δ受體與β-arrestin 1蛋白表達(dá)的測(cè)定 取藍(lán)斑核部位腦組織，以300 μl全細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行組織勻漿，提取組織蛋白(整個(gè)操作過程在冰浴中進(jìn)行)，測(cè)定蛋白濃度后，-80℃保存。取細(xì)胞總蛋白50μg，適量loading Buffer混勻，95℃水浴處理5 min，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，分別加入1∶500倍稀釋的δ受體與1∶1000倍稀釋的β-arrestin 1，室溫孵育1 h，再加入1∶5000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，曝光、顯影后分析條帶灰度，校正各蛋白的表達(dá)水平，分析δ受體與β-arrestin 1的蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以(±s)表示。各組間比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)，應(yīng)用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 大鼠痛閾值 給藥前，各組大鼠痛閾值無顯著性差異(P＞0.05)。M組大鼠注射嗎啡后，痛閾值較NS組明顯升高(P＜0.01)，隨著用藥次數(shù)增加，痛閾值逐漸降低，第9天痛閾值降至給藥前水平。MF2組與MF3組大鼠痛閾值的降低較M組緩慢，第7、9天MF2組與MF3組痛閾值均高于M組(P＜0.05)；MF1組大鼠注射嗎啡后痛閾值無改變(P＞0.05)。見表1。

2.2 δ受體表達(dá) 與NS組比較，M組δ受體mRNA及其蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.01)；與M組比較，MF1、MF2和MF3組δ受體mRNA及其蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1、圖2。

表1 各組大鼠給藥前后痛閾值的比較(s)

2.3 β-arrestin 1表達(dá) 與NS組比較，M組β-arrestin 1 mRNA及其蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.01)；與M組相比，MF2和MF3組β-arrestin 1 mRNA及其蛋白表達(dá)呈劑量依賴性增加(P＜0.05)，而MF1組則無顯著性差異(P＞0.05)。見圖3、圖4。

3 討論

建立慢性嗎啡耐受動(dòng)物模型的方法有多種，通過不同給藥劑量及途徑均可完成。衡量模型建立是否成功的主要標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物甩尾潛伏期在藥物使用后延長，并在給藥結(jié)束后恢復(fù)至給藥前水平[3]。實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用連續(xù)頸部皮下注射嗎啡的方法來建立大鼠慢性嗎啡耐受模型，將大鼠熱輻射甩尾潛伏期作為痛閾指標(biāo)，評(píng)價(jià)大鼠慢性嗎啡耐受的形成。本研究結(jié)果顯示，與NS組相比，M組大鼠第1天皮下注射嗎啡后痛閾值顯著升高，隨著給藥次數(shù)增加，大鼠痛閾值逐漸降低，在第9天降至給藥前水平，說明慢性嗎啡耐受大鼠模型建立有效；并且，聯(lián)合應(yīng)用芬太尼6 μg/kg、12 μg/kg后，可使慢性嗎啡耐受大鼠痛閾值增加，部分減輕大鼠嗎啡耐受。

δ受體是嗎啡作用的靶受體之一，在慢性嗎啡耐受形成過程中起著重要作用，主要參于阿片類藥物脊髓水平以上的鎮(zhèn)痛作用及某些情緒反應(yīng)，同時(shí)也參與μ受體介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[4]。δ受體在藍(lán)斑核部位分布更為密集。大鼠產(chǎn)生慢性嗎啡依賴后，其藍(lán)斑核的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核膜內(nèi)陷，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒脫落及碎裂，突觸前小泡聚積等[5]；并且嗎啡能夠抑制藍(lán)斑核神經(jīng)元的放電頻率，在給予阿片受體阻斷劑后，神經(jīng)元的放電頻率得以恢復(fù)[6]，說明藍(lán)斑核是參與慢性嗎啡耐受形成機(jī)制中的重要部位。

δ受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員，與激動(dòng)劑結(jié)合后，發(fā)生磷酸化，與G蛋白結(jié)合，G蛋白隨之發(fā)生構(gòu)象改變，Gα亞基上的GDP被GTP所取代，δ受體與G蛋白脫離，與胞漿內(nèi)的β-arrestin 1結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這一過程為受體脫敏與內(nèi)吞[7]。受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可再通過脫磷酸復(fù)敏，回到細(xì)胞膜表面，重新恢復(fù)和配體結(jié)合能力。

本研究結(jié)果顯示，大鼠產(chǎn)生慢性嗎啡耐受后，其藍(lán)斑核δ受體與β-arrestin 1的mRNA與蛋白表達(dá)均明顯降低，這與Gomes等[1]和Fan等[8]的研究結(jié)論是一致的。在嗎啡耐受研究方面，有學(xué)者認(rèn)為不同的阿片類藥物誘導(dǎo)受體發(fā)生脫敏與內(nèi)吞的水平不同，Whistler等[9]與Alvarez等[10]提出“RA/VE值”概念，即阿片類藥物效能與其誘導(dǎo)受體內(nèi)吞能力的比值。嗎啡的RA/VE值為8.5[2]，高于其他阿片類藥物如芬太尼、美沙酮等；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)嗎啡誘導(dǎo)依賴GRKs催化受體磷酸化的能力很弱[11]，阻礙受體內(nèi)吞過程，甚至神經(jīng)元在接受嗎啡預(yù)處理后，埃托啡誘導(dǎo)的阿片受體內(nèi)吞受到阻礙[12]。在受體發(fā)生內(nèi)吞過程中，細(xì)胞信號(hào)蛋白β-arrestin與受體相結(jié)合，并使之與G蛋白解偶聯(lián)是一關(guān)鍵步驟。β-arrestin 1以激動(dòng)劑增強(qiáng)的方式與δ受體直接作用，而去除δ受體C末端后這種作用被減弱[13]。雙鏈RNAi技術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，β-arrestin 1參與磷酸化δ受體內(nèi)吞過程[14]。既往研究結(jié)果表明，β-arrestin與磷酸化的阿片受體之間具有更高的親和力，易于與之結(jié)合[15]。因此，可以推斷由于嗎啡的高RA/VE值，誘導(dǎo)依賴GRKs催化受體磷酸化能力很弱，使受體水平磷酸化基團(tuán)減少，不易與β-arrestin結(jié)合，減少可磷酸化的阿片受體數(shù)量，并且使β-arrestin 1表達(dá)也處于低水平狀態(tài)。

DAMGO是μ受體激動(dòng)劑，RA/VE值為1.0，將其給予慢性嗎啡耐受大鼠，可減輕大鼠慢性嗎啡耐受程度，增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)，說明聯(lián)合應(yīng)用低RA/VE值的μ受體激動(dòng)劑可減緩慢性嗎啡耐受的發(fā)生[16]。芬太尼是臨床常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥，與嗎啡相比，不易誘發(fā)阿片耐受，它同時(shí)作用于μ、δ受體，RA/VE值僅為1.8，與DAMGO相近；在激動(dòng)μ受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，不影響μ受體內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞[17]，但對(duì)δ受體是否具有相同作用尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，為避免聯(lián)合使用阿片類藥物可能產(chǎn)生的副作用，芬太尼使用劑量為3 μg/kg、6 μg/kg、12 μg/kg，均低于大鼠芬太尼 ED5013 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芬太尼 6 μg/kg、12 μg/kg使慢性嗎啡耐受大鼠痛閾值增加，說明大鼠慢性嗎啡耐受程度有所減輕；但芬太尼6 μg/kg、12 μg/kg并沒有上調(diào)藍(lán)斑部位δ受體mRNA及蛋白表達(dá)，也就是說δ受體數(shù)量并無增加，說明小劑量芬太尼無法通過上調(diào)δ受體表達(dá)延緩慢性嗎啡耐受產(chǎn)生，δ受體脫敏與內(nèi)吞過程可能受阻；但在芬太尼6 μg/kg、12 μg/kg作用下，大鼠藍(lán)斑核β-arrestin 1 mRNA及蛋白表達(dá)有所上調(diào)，而相應(yīng)地δ受體表達(dá)卻沒有增加，推測(cè)主要可能有以下兩種原因：一是由于嗎啡的高RA/VE值，減少δ受體磷酸化基團(tuán)，使可磷酸化δ受體數(shù)量降低；二是與δ受體的代謝途徑有關(guān)，該受體內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，大部分快速進(jìn)入溶酶體被蛋白酶降解[18]。芬太尼3 μg/kg無上述作用，可能與使用劑量過低、無法有效激動(dòng)受體有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中仍存在許多有待深入研究的地方。在阿片受體的脫敏與內(nèi)吞過程中除β-arrestin 1之外，GRKs也發(fā)揮重要作用，值得我們關(guān)注。此外，細(xì)胞表面的阿片受體的磷酸化位點(diǎn)、受體之間的相互作用也需進(jìn)一步探討。

綜上所述，芬太尼6 μg/kg、12μ g/kg可增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用，部分延緩大鼠慢性嗎啡耐受產(chǎn)生，其藍(lán)斑部位β-arrestin 1 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào)參與這一過程，但詳盡作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1]Gomes I,Gupta A,Filipovska J,et al.A role for heterodimerization of mu and delta opiate receptors in enhancing morphine analgesia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9):5135-5139.

[2]Hashimoto T,Saito Y,Yamada K,et al.Enhancement of morphine analgesic effect with induction of mu-opioid receptor endocytosis in rats[J].Anesthesiology,2006,105(3):574-580.

[3]Emmett-Oglesby MW,Shippenberg TS,Herz A,et al.Fentanyl and morphine discrimination in rats continuously infused with fentanyl[J].Behav Pharmacol,1989,1(1):3-11.

[4]Simonin F,Befort K,Gavériaux-Ruff C,et al.The human delta-opioid receptor:genomic organization,cDNA cloning,functional expression,and distribution in human brain[J].Mol Pharmacol,1994,46(3):1015-1021.

[5]Miao H,Qin BY,Yang Y,et al.Ultrastructural changes in rat locus coeruleus by chronic opioids[J].Acta Neuropathol Berl,1997,94(2):109-115.

[6]Holland LN,Shuster JJ,Buccafusco,et al.Role of spinal and superspinal muscarinic receptor in the expression of morphine withdrawal symptoms in the rat[J].Neuropharmacology,1993,32(12):1387-1395.

[7]Müller W,Hallermann S,Swandulla D,et al.Opioidergic modulation of voltage-activated K+currents in magnocellular neurons of the supraoptic nucleus in rat[J].J Neurol Physiol,1999,81(7):1617-1625.

[8]Fan XL.Differential regulation of β-arrestin 1 and β-arrestin 2 gene expression in rat brain by morphine[J].Neuroscience,2003,117(11):383-389.

[9]Whistler JL,Enquist J,Marley A,et al.Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors[J].Science,2002,297(21):615-620.

[10]Alvarez V,Arttamangkul S,Williams JT.A RAVE about opioid withdrawal[J].Neuron,2001,32(8):761-763.

[11]Zhang J,Ferguson SS,Barak LS,et al.Role for G protein coupled receptor kinase in agonist-specific regulation of mu opioid receptor responsiveness[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(12):7157-7162.

[12]Koch T,Schulz S,Pfeiffer M,et al.C-terminal splice variants of the mouse mu-opioid receptor differ in morphine induced internalization and receptor resensitization[J].J Biol Chem,2001,276(10):31408-31414.

[13]Cen B,Xiong Y,Ma L,et al.Direct and differential interaction of beta-arrestins with the intracellular domains of different opioid receptors[J].Mol Pharmacol,2001,59(5):758-764.

[14]Zhang X,Wang F,Chen X,et al.Beta-arrestin 1 and beta-arrestin 2 are differentially required for phosphorylation-dependant and-independent internalization of delta-opioid receptors[J].J Neurochem,2005,95(6):169-178.

[15]Gurevich V,Gurevich EV.The molecular acrobatics of arrestin activation[J].Trends Pharmacol Sci,2004,25(7):105-111.

[16]Whistler JL,He Li,Fong J.Regulation of Opioid Receptor Trafficking and morphine tolerance by receptor oligomerization[J].Cell,2003,108(4):271-282

[17]Zuo Z.The role of opioid receptor internalization and β-arrestins in the development of opioid tolerance[J].Anesth Analg,2005,101(5):728-734.

[18]Morinville A,Cahill CM,Esdaile MJ,et al.Regulation of delta-opioid receptor trafficking via mu-opioid receptor stimulation:evidence from mu-opioid receptor knock-out mice[J].J Neurosci,2003,23(6):4888-4898.