林述琨 王耀鵬 溫吉海

1.大連，普蘭店市中心醫(yī)院病理科；2.普蘭店市中心醫(yī)院肺外科

肺癌是對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 早期研究表明在部分人類癌癥發(fā)病機(jī)制中MicroRNA(miRNA)的改變可能參與調(diào)控[1]。小分子RNA(miRNAs)是一種內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA，成熟miRNA主要通過與靶基因的3UTR區(qū)特異結(jié)合來抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，引起靶基因mRNA發(fā)生降解或翻譯受到抑制，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[2]。miRNA被認(rèn)為在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用如擴(kuò)散、生長、分化與細(xì)胞凋亡[3,4]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在乳腺癌、 胃癌、直腸癌及白血病等許多惡性腫瘤的發(fā)生過程起著癌基因及抑癌基因作用。但對于miRNA在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用還知之甚少[5]。本研究構(gòu)建了miR-214的真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞，以探討其對A549細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞株A549，用含有10%新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，按照lipo2000(Invitrogen公司)說明書的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 Real-time PCR用Trizol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Takara)。miR-214的反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CTG CC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′- GGA CAG CAG GCA CAG ACA-3′，下游引物5′- CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。以U6為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；real-time PCR引物序列：上游引物5′-TGC GGG TGC TCC GCT TCG GCA GC-3′，下游引物5′-CAG TGC AGG GTC CGA GGT-3′。使用SYBR Green(Takara)染料法進(jìn)行反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性10min，95℃變性5s，60℃退火34s，74℃熒光檢測3s，共40個循環(huán)。以2–ΔΔCt值比較兩者之間的差異。每組重復(fù)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 miR-214表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)miR-214前體在GenBank中的序列，設(shè)計PCR引物，引物序列為：Forward：5'-CTG TTA CGC AAA TTA TCC ATG TT-3'，Reverse：5'-AAT GGG TTT TAT TAT ATT TCA TA -3'(引入HindⅢ和XhoⅠ 酶切位點(diǎn))，目的片段亞克隆到pCDNA3.1(+)上，經(jīng)測序和Real-time PCR驗(yàn)證。

1.4 MTT法取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞，用含有10%新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液終止消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/ml，制備單細(xì)胞懸液。各取500μl接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3個平行復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用1ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，稀釋5倍后接種于96孔板(每組設(shè)6個重復(fù))，分別于接種后24、48、72h和96h，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄上清液，加入DMSO100μl/孔，振蕩處理溶解結(jié)晶紫，在酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處測吸光度(OD)值。

1.5 Transwell小室將A549細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板，在細(xì)胞融合度達(dá)80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6h后更換為完全培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)18h，然后用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，加入2ml完全培養(yǎng)液終止消化，離心后用Opti-MEM調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個/ml的單細(xì)胞懸液。取100μl單細(xì)胞懸液移至上室內(nèi)，下室中加入600μl含10%新生牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，每組設(shè)3個平行復(fù)孔。取出小室，移走上室內(nèi)的培養(yǎng)液，用滅菌的棉棒將上室內(nèi)的細(xì)胞輕輕刮掉，置于0.1%結(jié)晶紫染色液中染色30min，取出小室，在蒸餾水中將其漂洗3次。倒置顯微鏡下觀察通過小室基膜的細(xì)胞并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR-214 真核表達(dá)質(zhì)粒重 組 質(zhì) 粒pcDNA 3.1(+)-miR-214經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，電泳結(jié)果顯示得到2個片段，分別為534bp的miR-214和5405bp的線性pcDNA3.1(+)載體 ，結(jié)果與理論值相符合(見圖1)。

圖1 瓊脂糖電泳鑒定重組pcDNA3.1(+)-miR-214真核表達(dá)載體

圖2 Real-time PCR法鑒定miR-214表達(dá)

2.2 pcDNA3.1(+)-miR-214轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后miR-214過表達(dá)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)-miR-214轉(zhuǎn) 染 組，與 pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組相比，pcDNA3.1(+)-miR-214 轉(zhuǎn)染組 中miR-214的mRNA的表達(dá)量明顯增加 (P<0.01)，見圖2。表明構(gòu)建獲得的重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-miR-214能夠在人A549細(xì)胞中高水平地表達(dá)miR-214。

2.3 miR-214對A549細(xì)胞增殖能力的影響MTT法檢測結(jié)果提示，在24h、48h、72h和96h時，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-214重組質(zhì)粒組細(xì)胞的增殖速度明顯的低于pcDNA3.1(+)空載體組和空白對照組(blank control)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 MiR-214對A549細(xì)胞侵襲能力的影響通過transwell小室比較A549細(xì)胞在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-214后細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-214組穿膜細(xì)胞數(shù)為(57.67±7.02)個/視野，而pcDNA3.1(+) 空載體組和空白對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(182±15.4)個/視野和(178±24.97)個/視野(見圖4)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-214組 與 pcDNA3.1(+)空載體組和空白對照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明，miR-214能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

圖4 Transwell小室檢測A549細(xì)胞侵襲能力(×200)，*P<0.05

3. 討論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因。近年的研究表明，microRNA與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；在多種腫瘤的發(fā)生過程中起到癌基因和抑癌的作用。研究報道m(xù)iR-214肝癌、宮頸癌和乳腺癌中低表達(dá)，miR-214可以抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-9]。然而，迄今為止miR-214在肺癌中的作用未見報道。

本研究首先構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-miR-214重組質(zhì)粒，該方法能夠較好地模擬體內(nèi)miRNAs成熟的過程；該載體在多克隆位點(diǎn)上游有CMV啟動子，依賴于polymeraseⅡ，有較強(qiáng)的活性，是真核過表達(dá)最常用的啟動子，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，能夠使插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)；Amp＋和neo＋抗性基因便于進(jìn)行構(gòu)建和G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系[14]。與病毒載體[15]相比，其操作過程相對簡便，一般的實(shí)驗(yàn)條件即可完成。

為了檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后是否能夠高表達(dá)miR-214，本研究首先通過real-time PCR檢測A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-miR-214、空載體pcDNA3.1(+)和空白對照組中miR-214表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-miR-214后A549細(xì)胞內(nèi)miR-214過表達(dá)。

我們進(jìn)一步研究了miR-214在肺癌A549細(xì)胞中的功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-214可明顯影響A549細(xì)胞的增殖能力，這種增殖能力的改變是否引起細(xì)胞周期的改變，是否對腫瘤細(xì)胞的進(jìn)程起到抑制作用，將有待進(jìn)一步深入研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-214過表達(dá)能夠明顯抑制A549細(xì)胞的侵襲能力，這可能是由于miR-214的過表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)水平改變所致。目前研究認(rèn)為，以上這些生物學(xué)功能的改變多是miR-214引起其靶基因的改變所致；本課題組將在下一步的研究中進(jìn)一步探討?？傊?，本研究結(jié)果表明，miR-214具有抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲能力改變，是肺癌生物治療中的一個可能的候選靶點(diǎn)。

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