雷崎方，斯建勇

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

附子化學(xué)成分含量測(cè)定方法研究進(jìn)展

雷崎方，斯建勇*

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193

附子是中藥中“回陽(yáng)救逆第一品藥”，具有強(qiáng)心、抗休克、抗心律失常、抗炎鎮(zhèn)痛等功效。本文在分析附子相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，概括了附子中化學(xué)成分的含量測(cè)定方法的研究現(xiàn)狀，對(duì)其主要活性成分生物堿類(lèi)、嘧啶類(lèi)、多糖類(lèi)及微量元素的含量測(cè)定方法進(jìn)行了介紹和討論，涉及的方法包括滴定法、分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管電泳法等，為進(jìn)一步全面有效控制附子的質(zhì)量以及附子活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究與開(kāi)發(fā)提供參考。附子;化學(xué)成分;生物堿;含量測(cè)定;綜述

附子為常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?！吨袊?guó)藥典》2010版一部收載的附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli debx.的子根的加工品，產(chǎn)于四川、湖北、湖南等地［1］。附子屬溫里藥，是中藥中“回陽(yáng)救逆第一品”，具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛的功效。附子所含化學(xué)成分主要是生物堿，此外還含有苷類(lèi)、甾醇類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等，附子的有效成分尚未完全闡明，生物堿類(lèi)既是其毒效成分，也是附子的有效成分之一。隨著化學(xué)和藥理研究的不斷深入，附子中的其他成分，如尿嘧啶、多糖及微量元素也被分離得到并被證明具有一定的藥理活性。2010版藥典中共收載處方中含有附子的中成藥制劑共27種，其中有16種要求檢查烏頭堿的含量，由此可見(jiàn)要有效控制附子的質(zhì)量，主要是控制附子中的毒效和有效成分。本文在整理附子相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，就近十年來(lái)有關(guān)附子化學(xué)成分的分析方法進(jìn)展情況做一歸納和評(píng)述，為附子乃至烏頭中有效與毒效成分的質(zhì)量控制提供參考。

1 生物堿的含量測(cè)定

1.1 總生物堿的含量測(cè)定

1.1.1 酸堿中和法

可以用酸直接滴定，也可以先加定量酸液及指示劑再用氫氧化鈉回滴定。由于直接滴定法終點(diǎn)突破不明顯，難以判斷，報(bào)道中多采用回滴定法，一般以甲基紅為指示劑，氫氧化鈉滴至黃色，可用于檢測(cè)不同炮制方法對(duì)附子總生物堿含量影響的動(dòng)態(tài)影響情況［2］，以及不同煎煮時(shí)間對(duì)附子總生物堿的影響［3］。此法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確性穩(wěn)定性較理想，但靈敏度低，所需要的樣品量大。

1.1.2 分光光度法

主要采用以下兩種方法:一、酸性染料比色法，即利用生物堿與酸性染料如溴甲酚綠、溴麝香草酚藍(lán)等在一定pH條件下絡(luò)和生成離子對(duì)化合物后再進(jìn)行比色測(cè)定的方法。由于該離子對(duì)化合物是疏水性的，一般用氯仿為溶劑，若以氯仿進(jìn)行萃取，此法又可稱(chēng)為“離子對(duì)萃取-分光光度法”。目前，已采用此法對(duì)附子及其制劑的總堿含量進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定條件見(jiàn)表1。此法雖然其實(shí)驗(yàn)結(jié)果受溶液pH影響大，在操作過(guò)程中應(yīng)使用好緩沖鹽維持溶液pH的穩(wěn)定性，另外指示劑配制、處理均影響呈色穩(wěn)定性，顏色穩(wěn)定時(shí)間較短，需用對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，但在控制好實(shí)驗(yàn)條件的情況下，此法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行、專(zhuān)屬性好，易于推廣。二、一階導(dǎo)數(shù)UV光譜法，龍沛霞等［4］采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定制川烏、制草烏及附子中烏頭生物堿含量。測(cè)得結(jié)果與中國(guó)藥典(1995年版)方法的測(cè)定結(jié)果比較無(wú)顯著差異，而該方法操作起來(lái)更簡(jiǎn)便。

表1 酸性染料比色法測(cè)定附子及其制劑總生物堿含量的條件Table 1 Determination of total alkaloids in Fuzi and preparations by acid dye colorimetry

1.1.3 非水滴定法

又稱(chēng)堿量法［14］，取粉末用氨水堿化后，在索氏提取器中用乙醚提取，醚液再用0.1 mo1/L硫酸溶液提取，酸液經(jīng)堿化后用氯仿提取，氯仿提取液用無(wú)水硫酸鈉干燥后，蒸去氯仿，用乙醚溶解，再蒸去乙醚，殘?jiān)苡诖佐?，?.01 mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以甲基紫為指示劑，所得總生物堿以烏頭堿計(jì)算。此法現(xiàn)在使用較少。

1.2 酯型生物堿的含量測(cè)定

附子中生物堿包含雙酯型生物堿、單酯型生物堿、醇胺型生物堿和其他類(lèi)生物堿，這幾種生物堿的毒性差異極大，單酯型生物堿為雙酯型生物堿的1/ 100～1/200，醇胺型生物堿為雙酯型生物堿的1/ 2000～1/4000，因此要衡量附子的毒性應(yīng)以附子中的酯型生物堿，尤其是雙酯型生物堿為指標(biāo)。

1.2.1 改良的異羥戊酸反應(yīng)-高氯酸鐵分光光度法

生附片及附子蒸制品和煮制品［2］、參附注射液、附子注射液、金匱腎氣丸、附子理中丸、三生針等［15］經(jīng)處理后，加入堿性鹽酸羥胺，60℃水浴10 min，再加高氯酸鐵試液及pH=0.5的高氯酸顯色，于525 nm處測(cè)定，可得到酯型生物堿的總量。此法實(shí)用、操作簡(jiǎn)單、不需要高精儀器設(shè)備，但該法靈敏度低，干擾因素較多，重現(xiàn)性不夠理想。

1.2.2 離子選擇電極法

該法是利用四苯硼-烏頭類(lèi)生物堿活性物質(zhì)研制的電化學(xué)檢測(cè)器，其電極電位在烏頭類(lèi)生物堿一定的濃度范圍內(nèi)符合Nernst方程，可建立起相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，從而直接對(duì)烏頭類(lèi)生物堿進(jìn)行定量測(cè)定。徐紅雨［16］報(bào)道了四苯硼-烏頭類(lèi)生物堿活性物質(zhì)的方法，所制的石墨涂抹電極對(duì)烏頭類(lèi)生物堿響應(yīng)良好，并運(yùn)用此法測(cè)定了不同產(chǎn)地的附子及不同的附子炮制品中烏頭類(lèi)生物堿的含量，認(rèn)為此法選擇性高，不另需要內(nèi)參比電極和內(nèi)參比溶液，成本低廉，制作簡(jiǎn)單，使用方便，利于推廣。

1.2.3 復(fù)合緩沖紙層析-UV比色法［17］

此法可以測(cè)定附子中雙酯型生物堿的總量。方法是在濾紙上涂布不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，以苯-石油醚(5∶1)上行展開(kāi)后，層析紙于254 nm下觀(guān)測(cè)熒光，剪下pH=3藍(lán)色熒光帶，用95%乙醇洗脫后進(jìn)行比色測(cè)定。此法的原理是單酯型生物堿及醇胺型生物堿中含的羥醇類(lèi)成分是其在復(fù)合緩沖紙層析上的位置都集中在pH=7區(qū)段以下，此法較為簡(jiǎn)單易行。

1.2.4 氣相色譜法

戴忠等［18］采用氣相色譜法測(cè)定了風(fēng)濕骨痛酒中的酯型烏頭堿含量。色譜柱為2 m×3 mm玻璃柱填充102酸洗白色擔(dān)體(80～100目);固體相10%DEGS+1%H3PO4;檢測(cè)器FID(230℃);載氣為氮?dú)?柱溫195℃，平均回收率為98.4%。此法檢測(cè)靈敏度高，樣品用量少，可作為附子及其復(fù)方制劑中酯型生物堿的含量測(cè)定提供參考。

1.3 單個(gè)生物堿的含量測(cè)定

1.3.1 薄層掃描法

該法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，能快速準(zhǔn)確的進(jìn)行定性定量檢查，多用于毒性成分烏頭堿的含量測(cè)定與限量檢查，現(xiàn)將從文獻(xiàn)中收集的用薄層掃描法測(cè)定藥材或制劑中烏頭堿含量的色譜條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2中，以供參考。

表2 薄層掃描法測(cè)定附子及其制劑烏頭堿含量的條件及結(jié)果Table 2 Determination of aconitine in Fuzi and its prepatation bu TLCS

1.3.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法既具有高溫、高速、高靈敏度、高分辨度等優(yōu)點(diǎn)，因其測(cè)定成分多，結(jié)果準(zhǔn)確而極受歡迎［25］。附子中的生物堿極性較強(qiáng)，比較適合用高效液相色譜分析［26］。可通過(guò)控制流動(dòng)相的組成和配比使被分析生物堿達(dá)到基線(xiàn)分離而被分析，常用的流動(dòng)相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系統(tǒng)、甲醇-水-氯仿-二乙胺系統(tǒng)、甲醇-水-乙腈系統(tǒng)、無(wú)水乙醇-醋酸銨系統(tǒng)、乙腈-醋酸銨系統(tǒng)等。

1.3.2.1 紫外檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器是高效液相色譜最常用的檢測(cè)器，具有靈敏度高，穩(wěn)定性好，線(xiàn)形范圍廣等特點(diǎn)，但只適用于具有紫外吸收的烏頭類(lèi)生物堿的含量測(cè)定。已可同時(shí)測(cè)定六種烏頭類(lèi)生物堿的含量，現(xiàn)將文獻(xiàn)報(bào)道中常用的色譜條件列于表3。

表3 高效液相色譜法測(cè)定附子中生物堿常用色譜條件Table 3 Determination of alkaloids content from Fuzi by HPLC

烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿［32］ Ulti-mateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 乙腈-0.2%冰醋酸(濃氨水調(diào)節(jié)pH=7.29) 230 nm烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿［33］ Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) 40 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈(梯度洗脫) 235 nm烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、北烏堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿［34］AichromBond-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)乙腈-5mmol/L NaH2PO4溶液，磷酸調(diào)至pH=4.5，內(nèi)含7mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS) 235 nm

1.3.2.2 液質(zhì)聯(lián)用 集合了液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和極強(qiáng)的定性專(zhuān)屬性于一體，不僅能測(cè)定附子及其制劑中無(wú)紫外吸收生物堿的含量，還能對(duì)烏頭堿水解產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，幫助確定生物堿的結(jié)構(gòu)類(lèi)型等。Koji Wada等［35］采用大氣壓化學(xué)電離技術(shù)(APCI-MS)，對(duì) kobusine、pseudokobusine、dehydrolu-cidusculine等6種不含苯甲?；纳飰A進(jìn)行測(cè)定。Hikoto等［36］利用固相提取技術(shù)，提取人血液及尿中的微量雙酯型烏頭堿及其代謝產(chǎn)物后，用HPLC色譜柱分離，SIM-FABMS檢測(cè)器檢測(cè)，可分析14種烏頭堿的含量。高瞰等［37］用Venusil Mp-C18柱對(duì)生物驗(yàn)材進(jìn)行分離，采用ESI多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式，建立了快速測(cè)定生物驗(yàn)材中烏頭堿的含量，測(cè)定的線(xiàn)性范圍為3～5000 ng/mL，RSD＜1.8%，日間和日內(nèi)精密度分別為2.5%和4.6%，提取回收率為85.61% ～89.04%。Wei Wu等［38］利用場(chǎng)解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)建立了能夠同時(shí)檢測(cè)32種附子及其炮制品中生物堿含量的方法，此法比ESI-MS法所用時(shí)間更短，重現(xiàn)性更好。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，液質(zhì)聯(lián)用將成為分析方法新的方向。

1.3.2.3 超高效液相色譜法 該測(cè)定方法具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、快速的優(yōu)點(diǎn)，是正在興起的一種分離方法，適用于中藥及其復(fù)方體內(nèi)代謝化學(xué)的研究。王瑞等［39］采用UPLC/ESI/MS/MS聯(lián)用技術(shù)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式，在體外血漿溫孵試驗(yàn)和急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中附子總生物堿主要成分(烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿)濃度的方法;同時(shí)測(cè)定了大鼠血漿中附子總堿各主要成分的濃度;優(yōu)化的色譜條件為Acquity UPLCTMBEH C18柱，乙腈-0.05%氨水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，3種生物堿類(lèi)成分在3min內(nèi)即可完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定;血漿樣品提取回收率均高于85%，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于6%。

1.3.3 高效毛細(xì)管電泳法

劉春海等［40］在色譜條件為:緩沖液:0.3 mol/L磷酸緩沖液(pH=6.8);毛細(xì)管柱:內(nèi)徑50 μm，有效長(zhǎng)度56 cm;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;溫度:25℃;電壓: 20 Kv;進(jìn)樣量:100 mbar·s時(shí)，以烏頭堿為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而測(cè)得溫脾湯中烏頭堿的含量;虞巧英［41］用未涂層石英毛細(xì)管(75 μm×50 μm，有效長(zhǎng)度42.5 cm)，以1.0 mmol/L的14-羥基-乙酰苯標(biāo)準(zhǔn)溶液為內(nèi)標(biāo)溶液，0.3 mol/L磷酸液(pH=6.8)為電泳緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;溫度:25℃;電壓: 20 Kv;進(jìn)樣量100 mbar·s的電泳條件下測(cè)定了附子與甘草配伍前后烏頭堿的含量變化。Zhao等［42］建立了新的紀(jì)錄模式，運(yùn)用非水毛細(xì)管電泳法，即以20 mM硼酸鈉-70%(v/v)甲醇(pH=8.5)為電泳緩沖液，未涂層石英毛細(xì)管(50 cm×75 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，電壓20 Kv的色譜條件下對(duì)附子等五種中藥中的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，整個(gè)過(guò)程可在13分鐘內(nèi)完成，且大大改善了實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性;Song等［43］以pH=7.8的200 mMTis、150 mM高氯酸、40%1，4-二氧己烷的混合液為緩沖溶液(25℃)同時(shí)測(cè)定了附子中六種生物堿的含量。與HPLC相比，HPCE具有分離時(shí)間短，雜質(zhì)干擾少，使用有機(jī)溶劑少，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有應(yīng)用前景的分析方法。

2 尿嘧啶的含量測(cè)定

從附子中分離得到的尿嘧啶經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有一定的正性肌力作用，被認(rèn)為是附子強(qiáng)心活性的有效成分之一［44］。

洪波［45］以0.2%無(wú)水碳酸鈉溶液超聲提取生附子，色譜條件為:Hypersile C18(4.60 mm×250 mm，5 μm)分析柱，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸氫二銨溶液，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫20℃，測(cè)得尿嘧啶的含量，平均回收率為100.04%，RSD為1.84%，還采用同樣的方法測(cè)定了黑附片、白順片、鹽附子中尿嘧啶的含量。

3 多糖的含量測(cè)定

中草藥多糖在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤、抗肝炎、抗?jié)?、調(diào)血脂、降血糖、抗衰老等方面都有作用［46］。附子多糖以其高效低毒的生物學(xué)特性，近年來(lái)逐漸受到人們的關(guān)注，是新藥研發(fā)和食品保健方向之一。

趙祥生等［47］用蒽酮-硫酸比色法，以葡萄糖為對(duì)照品，測(cè)定了道地產(chǎn)區(qū)江油附子的多糖含量，供試液在6 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，平均回收率為90.4%，RSD=1.58%(n=5)，測(cè)得江油附子多糖含量為3.34%，RSD=2.31%。舒曉燕等［6］用蒽酮-硫酸法測(cè)定了不同品種附子多糖的含量，為附子的品種選育提供了一定的科學(xué)依據(jù)。此法方便簡(jiǎn)單，可作為附子多糖測(cè)定的優(yōu)選方法。

4 微量元素的含量測(cè)定

微量元素是中藥歸經(jīng)和藥性物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分，其含量與中藥的功效有著密切的關(guān)系［48］。對(duì)附子中的微量元素進(jìn)行分析，可對(duì)闡明其藥性理論與功能主治提供參考。

該法的原理［49］是將待測(cè)元素的分析溶液在高溫下進(jìn)行原子化，使其離解為基態(tài)原子，空心陰極燈發(fā)射出待測(cè)元素特征波長(zhǎng)的光輻射，并穿過(guò)原子化器中一定厚度的原子蒸氣，此時(shí)光的一部分被原子蒸氣中待測(cè)元素的基態(tài)原子吸收，根據(jù)朗伯比爾定律，吸光度的大小與待測(cè)元素的原子濃度成正比關(guān)系，即可求得待測(cè)元素的含量。張彩霞等［49］采用空氣—乙炔火焰原子吸收分光光度法(FAAS)對(duì)附子的常見(jiàn)炮制品中五種微量元素(Ca、Cu、Mg、Zn、Fe)的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黑順片中以Mg元素為主，白附片中以Ca元素為主，鹽附子中以Mg元素為主。此法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)良好。

5 結(jié)束語(yǔ)

5.1 隨著對(duì)附子研究的深入，對(duì)其化學(xué)成分的含量測(cè)定已經(jīng)逐漸由對(duì)烏頭類(lèi)生物堿向多糖類(lèi)、嘧啶類(lèi)、微量元素類(lèi)成分?jǐn)U展，由測(cè)定單一或少數(shù)同類(lèi)成分向同時(shí)測(cè)定多類(lèi)成分發(fā)展，以便更全面地控制附子藥材及其制劑的質(zhì)量，更有效地研究附子炮制與配伍機(jī)理以及在體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)。

5.2 在附子單個(gè)生物堿的含量測(cè)定上，主要還是集中在烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿及其對(duì)應(yīng)的單酯水解產(chǎn)物這六種，而化學(xué)成分分析的逐漸深入，已從附子中分離得到了其他二萜類(lèi)生物堿，同時(shí)在雙酯型生物堿經(jīng)過(guò)兩次水解后得到的低毒醇胺型生物堿的含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道，由于其沒(méi)有紫外吸收，故在用液相的方法進(jìn)行同時(shí)測(cè)定多種生物堿含量時(shí)可以考慮使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

5.3 各種分析方法均有其利弊，酸堿滴定法與紫外分光光度法簡(jiǎn)單易行但選擇性差;離子選擇電極法選擇性高但因需要制備活性物質(zhì)受到了實(shí)驗(yàn)條件的限制;薄層掃描法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，但影響因素多，測(cè)定誤差較大;高效液相色譜法準(zhǔn)確度高，分離效果好，能同時(shí)測(cè)定幾種化學(xué)成分的含量，但所用流動(dòng)相堿性較強(qiáng)，易破壞色譜柱固定相;氣相色譜法準(zhǔn)確、快速但在附子的研究中未得到推廣應(yīng)用;如今高效液相的應(yīng)用最為活躍，超高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、高效毛細(xì)管電泳技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)已在化學(xué)成分的含量測(cè)定中顯示了良好的應(yīng)用前景。

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Advances in Content Determination Methods of Chemical Constituents from Radix Aconiti Lateralis Preparata(Fuzi)

LEI Qi-fang，SI Jian-yong*
Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China

Radix Aconiti Lateralis Preparata(Fuzi)has been used as an essential drug in traditional Chinese medicine (TCM)for treating heart failure，shock，arrhythmia，inflammation and pain.The content determination methods of its mainly active chemical constituents including alkaloids，pyrimidines，polysaccharides and trace elements had been summarized that based on a wide range of literature investigations.In addition，we also generalized the applications of different analysis methods such as titrimetry，spectrophotometry，TLC-scanning，HPLC，LC-MS，HPCE，and so on.This review is in order to set a basis to conduct an appropriate quality control for Fuzi and to research the active constituents of Fuzi crude materials and ready-made products.

Radix Aconiti Lateralis Preparata;chemical constituents;alkaloids;content determination;review.

1001-6880(2012)10-1480-07

2010-12-20 接受日期:2011-03-21

國(guó)家973計(jì)劃(2009BC522805)

*通訊作者 Tel:86-10-57833299;Email:jysi@implad.ac.cn

R284.1

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