劉伶文，司 磊，任樹(shù)勇，劉永紅

西安工程大學(xué)西安710048

人腸道菌對(duì)黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化

劉伶文*，司 磊，任樹(shù)勇，劉永紅

西安工程大學(xué)西安710048

本研究利用體外培養(yǎng)人體腸道菌轉(zhuǎn)化黃芩苷，探索轉(zhuǎn)化方法及模型;用醇沉法提取了黃芩苷轉(zhuǎn)化酶，即β-D-葡萄糖醛酸苷酶，并探討了酶促影響因素;通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物黃芩素。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，黃芩苷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液經(jīng)超聲波處理后，在轉(zhuǎn)化液中有黃芩素檢出。實(shí)驗(yàn)得知，轉(zhuǎn)化酶為胞內(nèi)酶，該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適pH為6.0，Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)酶促反應(yīng)具有促進(jìn)作用，而Fe2+則具有抑制作用，Zn2+濃度在l mmol/L時(shí)起促進(jìn)作用，在5 mmol/L時(shí)起抑制作用。

腸道菌;生物轉(zhuǎn)化;黃芩苷;超聲波處理;β-D-葡萄糖醛酸苷酶

絕大多數(shù)中草藥以口服為主，藥物中的有效成分在進(jìn)入腸道之后與腸道菌群接觸，大多數(shù)要經(jīng)相應(yīng)腸道菌代謝轉(zhuǎn)化后被吸收。許多糖苷類藥物在腸道內(nèi)吸收很差，要經(jīng)腸道菌水解為相應(yīng)的苷元才可被吸收［1］。

黃芩為一著名中藥，主要成分為黃芩苷(baicalin)，其次為黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用［2］。黃芩苷為一分子葡萄糖醛酸的黃酮衍生物，水解后為苷元黃芩素和葡萄糖醛酸。黃芩苷在腸道內(nèi)難以被直接吸收，轉(zhuǎn)化為黃芩素才能被吸收入血液而發(fā)揮作用［3］。同時(shí)大量臨床藥效實(shí)驗(yàn)證明，黃芩素的藥理作用強(qiáng)于黃芩苷［3］。

黃芩素的制備方法有兩種:一種是從中藥黃芩中分離提取;另一種是水解黃芩苷制備黃芩素。在黃芩中，黃芩苷含量是黃芩素的數(shù)十倍［4］，從黃芩中直接提取黃芩素回收率很低。車慶明［5］采用混合酸與黃芩苷混合加熱回流來(lái)制備黃芩素，能源消耗大，且嚴(yán)重污染環(huán)境。采用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)黃芩素反應(yīng)溫和，易于控制，且無(wú)環(huán)境污染，汪紅［6］成功采用絲狀真菌—黑曲霉培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黃芩苷為黃芩素。目前用人腸道菌轉(zhuǎn)化黃芩苷的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用人體腸道菌體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黃芩苷，建立轉(zhuǎn)化模型，為生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素提供了一個(gè)新的途徑。

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃芩苷，西安小草植物科技有限公司;黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品，陜西省食品藥品檢驗(yàn)所;硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，陜西省食品藥品檢驗(yàn)所;維生素C，西安利君制藥有限責(zé)任公司;超純水，其他試劑為色譜純。

1.2 儀器

高效 液 相 色 譜 儀 (AgilentTechnoLogies-1200series);SK5200LH超聲波儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R); HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);752N紫外可見(jiàn)分光光度儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。三洋低溫冰箱 MDFU5411—40℃(日本三洋)。HV-50高壓滅菌氣鍋(浙江科通儀器有限公司)

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 黃芩苷轉(zhuǎn)化方法及模型

2.1.1 人腸道菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黃芩苷

稱取4.2 g硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，加水150 mL配制成液體培養(yǎng)基，加入黃芩苷5 g，煮沸后高壓滅菌，冷卻致室溫后加入2 g維生素C，配制成黃芩苷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。人腸道菌群混合液制備參照文獻(xiàn)［7］:取健康人的新鮮糞便2 g，立即加入150 mL培養(yǎng)基中，充分?jǐn)嚢韬笥?層紗布過(guò)濾，將濾液分裝于培養(yǎng)管中，采用套管法37℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 hr。

2.1.2 超聲破碎處理方法

超聲波處理可能提高黃芩苷的分散度和溶解性，有利于被轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化，也可能有破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的作用，使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化酶釋放到胞外環(huán)境中，有利于黃芩苷的轉(zhuǎn)化。設(shè)計(jì)不同的超聲波處理方法，確定在人腸道菌體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黃芩苷模型中合理的超聲波處理方法，以明確超聲波處理在此模型中的作用。設(shè)定超聲波頻率為40 KHz，處理時(shí)間為20 min，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 超聲波處理方法設(shè)計(jì)Table 1 Design of ultrasonic treatment

將處理結(jié)束的黃芩苷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液于10 000 rpm下離心10 min，取上清液濃縮，然后用30 mL甲醇溶解，再次離心后取上清液待檢測(cè)。

2.1.3 代謝產(chǎn)物高效液相色譜檢測(cè)

分別取黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液(20 μg/mL)、各組樣品上清液，用高效液相色譜儀(Agilent TechnoL-ogies-1200series)進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件:流動(dòng)相，甲醇∶水∶乙酸=65∶35∶0.2;波長(zhǎng)，275 nm;流速，1.0 mL/min，柱溫，28℃，進(jìn)樣量10 μL［8］。

2.2 黃芩苷轉(zhuǎn)化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶的提取

培養(yǎng)液經(jīng)40 KHz超聲波破碎處理40 min［9］，4℃、10 000 rpm離心20 min，取上清液為粗酶液，于4℃冰箱保存。取10 mL粗酶液，加入1.5倍體積的-25℃乙醇，再次冷凍離心，取沉淀物溶于pH 6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，低溫保存，為待測(cè)酶液。

2.2.2 酶活力的測(cè)定

酶活力的測(cè)定，可選用測(cè)定轉(zhuǎn)化液中黃芩苷的水解產(chǎn)物黃芩素含量的方法。黃芩素的測(cè)定選用紫外吸光光度法。黃芩素結(jié)構(gòu)中A環(huán)上有5，6，7三羥基結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū)279 nm處有最大吸收，可通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)后轉(zhuǎn)化液中黃芩素的含量來(lái)表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

2.2.2.1 黃芩素紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線

以甲醇為溶劑，配制3.0 mg/mL的黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋到40、50、60、80、100、125、160和200倍，將稀釋倍數(shù)換算為具體濃度，然后利用紫外分光光度計(jì)在279 nm處檢測(cè)其吸光度A值，以吸光度對(duì)溶液濃度作黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2.2 酶活力的測(cè)定方法

取0.15 mol/L黃芩苷溶液0.5 mL和0.5 mL酶液，加入含1 mL pH 6.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的試管中。將試管置于50℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL終止反應(yīng)，加入5 mL甲醇，微型漩渦混合儀混勻，在轉(zhuǎn)速10 000 rpm下離心時(shí)間10 min，離心結(jié)束后，取上清液用甲醇稀釋500倍備用。

以溶劑甲醇為空白參照，測(cè)定離心上清液中黃芩素的吸光度A值，根據(jù)黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中黃芩素的含量。以實(shí)驗(yàn)條件下每分鐘釋放出1 μmol黃芩素所需要的酶量為1U。

2.2.3 酶促反應(yīng)影響因素測(cè)定

測(cè)定反應(yīng)溫度、pH值、金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)的影響，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中酶活力的方法研究黃芩苷β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶學(xué)特性。

2.2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響:分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下測(cè)定酶活力，根據(jù)其酶活力的大小確定其酶的最適水解溫度。

2.2.3.2 pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響∶配制一系列磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。測(cè)定不同pH下樣品的酶活力，根據(jù)其酶活力的大小確定酶的最適水解pH。

2.2.3.3 金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)的影響:實(shí)驗(yàn)研究Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+和 Zn2+對(duì) β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影響。分別配制1 mmol/L和5 mmol/L的CaCl2、MgSO4、CuSO4、FeSO4和ZnSO4金屬鹽溶液，初步定性分析金屬離子對(duì)β-D-葡萄糖醛酸苷酶活性的影響。

3 結(jié)果分析

3.1 黃芩苷轉(zhuǎn)化方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品、各實(shí)驗(yàn)組的液相色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3和圖4。

由圖1可見(jiàn)黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品主峰，其保留時(shí)間為14.1 min。圖2、3在此處無(wú)吸收峰，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液中未檢測(cè)出黃芩素。圖4在此處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化液中檢測(cè)到黃芩素。

A組實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)腸道菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化黃芩苷，未進(jìn)行任何形式的超聲處理，無(wú)法收獲轉(zhuǎn)化物黃芩素。

B組實(shí)驗(yàn)在接種前對(duì)含有黃芩苷的培養(yǎng)基進(jìn)行超聲處理，旨在提高黃芩苷的分散度和溶解性，以利于黃芩苷被腸道細(xì)菌細(xì)胞吸收及轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)化效率。但在轉(zhuǎn)化液中未檢測(cè)出黃芩素，說(shuō)明在細(xì)菌胞外環(huán)境未發(fā)生黃芩苷的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化可能發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)。這種超聲波處理的方法不能收獲黃芩苷。

C組實(shí)驗(yàn)方法，腸道菌在黃芩苷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)超聲波處理，在轉(zhuǎn)化液中有黃芩素檢出，說(shuō)明此種方法的處理可以提取到黃芩素。超聲波處理一方面可提高黃芩苷的分散度和溶解性，有利于被轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化。更重要的是超聲波處理有破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的作用，使細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化酶釋放到胞外環(huán)境中，同時(shí)也使胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化的黃芩素被釋放，可以從轉(zhuǎn)化液中獲取黃芩素。這種超聲波處理方法有利于黃芩苷的轉(zhuǎn)化和黃芩素的提取。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較也可以得出，黃芩苷轉(zhuǎn)化酶為胞內(nèi)酶。

3.2 黃芩苷轉(zhuǎn)化酶的酶學(xué)性質(zhì)

3.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)定酶促反應(yīng)溶液的pH值為6.5、其他條件不變時(shí)，只改變酶促反應(yīng)的溫度，測(cè)定不同溫度下β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

由圖5可知，當(dāng)溫度由25℃上升到55℃時(shí)，酶活力逐漸升高。溫度達(dá)到55℃，酶活力達(dá)到最高，繼續(xù)升高溫度，酶活力開(kāi)始下降，當(dāng)溫度升高到60℃時(shí)，酶活力急速下降。溫度升到70℃時(shí)，幾乎無(wú)法測(cè)出酶活，斷定蛋白質(zhì)發(fā)生變性，酶已基本失活。實(shí)驗(yàn)測(cè)定β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最適溫度為55℃。

3.2.2 pH值對(duì)酶促反應(yīng)的影響

設(shè)定酶促反應(yīng)溫度為55℃，其他條件不變，僅改變反應(yīng)的pH值，測(cè)定不同pH值對(duì)酶活力的影響，見(jiàn)圖6所示。

由圖6可見(jiàn)，反應(yīng)環(huán)境pH由3.5上升到5.5時(shí)，酶活力逐漸升高。pH達(dá)5.5時(shí)，酶活力達(dá)到最高，繼續(xù)升高pH，酶活力逐漸下降。測(cè)得的β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力最適pH值為5.5。

3.2.3 金屬離子對(duì)酶促反應(yīng)的影響

圖7 金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on enzyme activity

設(shè)定環(huán)境反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)pH值為5.5，其他條件不變，以不含待測(cè)離子的β-D-葡萄糖醛酸苷酶的水解活性為100%，測(cè)定值與之相比較，得相對(duì)值，結(jié)果如圖7所示。圖中黑色圖柱為離子濃度1 mmol/L時(shí)酶活力，白色圖柱為離子濃度5 mmol/L是酶活力。斜線柱為未加金屬離子的空白對(duì)照。

由圖7可知，Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)酶促反應(yīng)具有促進(jìn)作用，可作為酶促反應(yīng)的激活劑;而Fe2+則具有抑制作用，可作為酶促反應(yīng)的抑制劑;Zn2+在低濃度下起促進(jìn)作用，在高濃度時(shí)起抑制作用。

4 結(jié)論

本研究建立了體外培養(yǎng)人腸道菌轉(zhuǎn)化黃芩苷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，為生物轉(zhuǎn)化黃芩苷制備黃芩素提供了新的途徑和理論支持

研究表明黃芩苷經(jīng)人腸道菌作用轉(zhuǎn)化為苷元黃芩素。對(duì)黃芩苷生物培養(yǎng)液進(jìn)行超聲波破碎處理，轉(zhuǎn)化酶釋放后，促使黃芩苷轉(zhuǎn)化和利于提取黃芩素。

黃芩苷轉(zhuǎn)化過(guò)程中起轉(zhuǎn)化作用的是黃芩苷-β-D-葡萄糖醛酸苷酶，該酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適pH值為6.0，金屬離子Ca2+、Mg2+和Cu2+對(duì)酶促反應(yīng)具有促進(jìn)作用，而Fe2+則具有抑制作用，Zn2+在低濃度下起促進(jìn)作用，高濃度時(shí)起抑制作用。實(shí)驗(yàn)中用紫外分光光度法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中黃芩素的含量來(lái)表示β-D-葡萄糖醛酸苷酶的活性。

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Biotransformation of Bacicalin by Human Intestinal Bacteria

LIU Ling-wen*，SI Lei，REN Shu-yong，LIU Yong-hong
Xi'an Polytechnic University，Xi’an 710048，China

The characteristic of human intestinal bacteria biotransformation system was studied.The enzyme(β-D-glucuronidase)was isolated by Alcohol precipitation，and the factors on enzymatic properties were analyzed.The product was identified as baicalein by high performance liquid chromatography(HPLC).After ultrasonic treatment on cultivation medium，the baicalein could be extracted.At pH 6.0 and 55℃，the activity of β-D-glucuronidase reached maximum，and was activated by Ca2+、Mg2+and Cu2+，but inhibited by Fe2+;at l mmol/L Zn2+played a catalytic role，but an inhibitory factor at 5 mmol/L.

intestinal bacteria;biotransformation;baicalin;ultrasonic treatment;β-D-glucuronidase

1001-6880(2012)10-1437-05

2012-02-22 接受日期:2012-05-24

陜西省教育廳專項(xiàng)科研項(xiàng)目(09JK453);陜西省科技廳工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2008k07-14)

*通訊作者 Tel:86-013310988359;Email:LingwenLiu1@sina.com

TQ 464

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