石 瑤，楊亞玲，李晚誼，劉謀盛

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院昆明650500;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所昆明650223

雙水相萃取麗江山慈菇中的秋水仙堿

石 瑤1，2，楊亞玲1*，李晚誼2，劉謀盛1

1昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院昆明650500;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所昆明650223

建立了由聚乙二醇(PEG6000)與(NH4)2SO4形成的雙水相體系萃取麗江山慈菇中秋水仙堿的新方法。考察了PEG分子量、PEG的濃度、(NH4)2SO4的濃度和pH值對(duì)雙水相成相及秋水仙堿萃取率的影響，并結(jié)合HPLC對(duì)萃取相進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH為7.0時(shí)，雙水相體系對(duì)麗江山慈菇粗提液中秋水仙堿萃取率達(dá)82.09%，富集倍數(shù)為6.84倍。此方法可用于麗江山慈菇中秋水仙堿的初步分離富集，且操作簡(jiǎn)單，綠色無(wú)污染。

麗江山慈菇;秋水仙堿;雙水相體系;HPLC

秋水仙堿是由百合科植物秋水仙中發(fā)現(xiàn)的一種重要的卓酚酮類生物堿，對(duì)細(xì)胞有絲分裂有明顯抑制作用，在臨床中主要作為抗癌藥物使用，此外，對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有特異治療作用，作為抗痛風(fēng)藥使用。我國(guó)主要從麗江山慈菇的鱗莖中獲得秋水仙堿。麗江山慈菇Iphigenia indica又名草貝母、假貝母、山慈菇，為百合科多年生草本，分布于我國(guó)西藏、四川和云南中部及西北部的草地、溝邊及松林中的酸性沙壤土及紅土地帶［1］。目前，從麗江山慈菇中提取秋水仙堿多用毒性較大的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，雙水相萃取技術(shù)用于秋水仙堿的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。

雙水相萃取技術(shù)(ATPE)以萃取條件溫和、操作簡(jiǎn)單、無(wú)有機(jī)溶劑殘留、過(guò)程易于放大等優(yōu)點(diǎn)在提取和分離蛋白質(zhì)、酶、氨基酸及抗生素等的研究報(bào)道很多［2-5］，而用于天然藥物有效成分提取和分離主要集中于黃酮類化合物的分離［6-11］，用于生物堿分離的報(bào)道很少。曾報(bào)道過(guò)運(yùn)用雙水相萃取技術(shù)及高效液相色譜從罌粟殼中提取測(cè)定罌粟堿［12］。本文研究了以聚乙二醇(PEG)和(NH4)2SO4構(gòu)成的雙水相萃取體系用于麗江山慈菇粗提液中秋水仙堿的萃取，獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料及化學(xué)試劑

原料:麗江山慈菇購(gòu)自云南藥材市場(chǎng);秋水仙堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所(批號(hào): 101176-201001)。

試劑:分子量分別為400、600、4000、6000的聚乙二醇(PEG)、硫酸銨、磷酸、硼酸、醋酸、氫氧化鈉均為分析純、乙腈為色譜純、水為超純水。

1.2 主要儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器)，R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)，KQ100DB超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，pH計(jì)(雷磁PHS-3C)，800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)，F(xiàn)A1004型萬(wàn)分之一分析天平(上海精科天平)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山慈菇粗提液的制備

稱取山慈菇粉1.0 g，以1∶8的料液比加入50%乙醇，于超聲儀中處理30 min，抽濾，收集濾液，濾渣重復(fù)提取一次，合并濾液，減壓濃縮至一定體積，得山慈菇粗提液。

1.3.2 雙水相萃取分離

雙水相體系按質(zhì)量配制，各組分用質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。將一定質(zhì)量的PEG及(NH4)2SO4加入至10 mL具塞刻度離心管中，加入一定量山慈菇粗提液，加水至10 g，充分混合振蕩溶解后，以3500 r/min離心5 min使其分相完全。此時(shí)，離心管中分為兩相，上相為PEG相，下相為鹽相。讀取上下相體積，取樣分析PEG相中秋水仙堿含量。相關(guān)計(jì)算公式如下:R=Vu/Vd，Y=(Cu×Vu)/(Co×Vo)×100%

式中:R-相比;Vu-上相體積;Vd-下相體積;Y-萃取率(%);Cu-秋水仙堿在上相中的質(zhì)量濃度(mg/ mL);Co-萃取前秋水仙堿的質(zhì)量濃度(mg/mL);Vo-萃取前體積。

1.3.3 秋水仙堿含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定麗江山慈菇粗提液及萃取液中秋水仙堿的含量。色譜條件:色譜柱:Agilent TC C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶水溶液(27∶73);流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;柱溫:室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系考察

對(duì)影響秋水仙堿萃取率的因素:PEG分子量、PEG的濃度、(NH4)2SO4的濃度和pH值進(jìn)行了考查研究，確定最適萃取條件。

2.1.1 PEG與(NH4)2SO4雙水相體系相圖

根據(jù)文獻(xiàn)［12］報(bào)道，制作了雙水相體系相圖見(jiàn)圖1。

圖1 PGE-(NH4)2SO4雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagrams of PGE-(NH4)2SO4aqueous two-phase systems

由圖1可見(jiàn)，PEG的分子量越大，雙節(jié)線越趨向于原點(diǎn)，成相的臨界濃度越低。隨著PEG分子量的增加，成相所需的PEG及(NH4)2SO4的濃度均逐漸減小。

2.1.2 PEG分子量對(duì)秋水仙堿萃取率的影響

PEG分子量大小與雙水相成相體系的組成及成相后的相比有很大關(guān)系。根據(jù)PGE-(NH4)2SO4相圖可知，隨著PEG分子量的增加，相同濃度的PEG成相所需的鹽的量逐漸減少，成相能力為PEG6000＞PEG4000＞PEG2000 ＞PEG600＞PEG400。本實(shí)驗(yàn) 在 PEG 質(zhì) 量 分?jǐn)?shù)為 8%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH=7.0的條件下，考察了PEG分子量大小對(duì)秋水仙堿萃取率的影響。結(jié)果如表1所示。

表1 PEG分子量對(duì)秋水仙堿萃取率的影響Table 1 Effect of PEG molecular mass on extraction efficiencies of colchicine

由表 1可以看出，在此條件下，PEG400及PEG600未能成相，PEG4000及PEG6000可以成相，且PEG6000萃取率最高。這是由于PEG分子量越低，其水溶性越好，成相的臨界濃度越高，所需的PEG的量也就越大，相比也隨之增大，這樣不利于秋水仙堿的富集。而隨著PEG分子量的增大，相同質(zhì)量的PEG中所含端基數(shù)目減小，使得與水形成氫鍵的位點(diǎn)減小，因而疏水性增加，且PEG分子間作用力增大，所以更容易成相［13］。故選擇PEG6000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 PEG的濃度對(duì)萃取率及相比的影響

考察了不同濃度PEG6000對(duì)秋水仙堿萃取率的影響。固定(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH= 7.0，分別選擇了五個(gè)不同濃度:PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，4%，6%，8%，10%，12%考察其對(duì)萃取率及相比的影響。結(jié)果如圖2、3所示。

由圖2、3可以看出，隨著PEG濃度的增加，相比不斷增大，上相體積增大，萃取率也隨之上升。PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，萃取率最高為85.5%，之后，隨著PEG量的增加，PEG相體積增大，但萃取率基本維持不變。這可能是由于PEG濃度增大，溶液黏度增大，反而不利于秋水仙堿進(jìn)入上相，故綜合考慮萃取率及富集效果，選擇PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 (NH4)2SO4濃度對(duì)萃取率及相比的影響

圖4 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of(NH4)2SO4concentration on extraction efficiencies of colchicine

鹽的濃度對(duì)雙水相成相后的相比及萃取率也有較大影響。固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，pH=7.0的條件下，考察了(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%，15%，18%，20%，25%，30%對(duì)萃取率及相比的影響。結(jié)果如圖4、5所示。

圖5 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)相比的影響Fig.5 Effect of(NH4)2SO4concentration on the phase ratio

由圖4、5可以看出，當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著(NH4)2SO4濃度的增加，萃取率逐漸升高，當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，萃取率達(dá)到最高為85.4%，之后反而下降。相比隨著鹽用量的增加而減小。在此體系中，(NH4)2SO4的濃度低于10%時(shí)，不能成相，高于30%后，鹽不能完全溶解，且過(guò)高的含鹽量對(duì)下一步進(jìn)HPLC檢測(cè)有影響，可能對(duì)C18柱有損害，故確定(NH4)2SO4用量為20%。

2.1.5 pH值對(duì)萃取率的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8%的 PEG6000及 20%的(NH4)2SO4制備雙水相體系，用三酸緩沖液調(diào)節(jié)體系pH值考察秋水仙堿的萃取率隨pH值的變化情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH值對(duì)萃取率的影響Fig.6 Effect of pH on extraction efficiencies of colchicine

由圖6可知，在pH為5.0～9.0的范圍內(nèi)，秋水仙堿萃取率逐漸升高，pH=7.0時(shí)，萃取率最高，達(dá)到86%。在偏堿性環(huán)境中，萃取率與在中性環(huán)境中基本一致。而酸性環(huán)境不利于秋水仙堿的萃取。故選擇pH=7.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 樣品分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:取適量秋水仙堿對(duì)照品，加入超純水配制0.2 mg/mL的對(duì)照品貯備液，精密吸取該貯備液，依次配制濃度為0.1，0.05，0.01，0.005，0.001 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取5 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，秋水仙堿對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=15595.48828X+ 0.84979，R2=0.99996，線性范圍:0.001～0.1 mg/ mL。此標(biāo)準(zhǔn)曲線用于粗提液中秋水仙堿含量及雙水相萃取后秋水仙堿萃取率及富集倍數(shù)計(jì)算。

2.2.2 樣品測(cè)定

用以上確定的最適雙水相萃取條件對(duì)麗江山慈菇粗提液進(jìn)行雙水相萃取后，進(jìn)HPLC檢測(cè)秋水仙堿含量，HPLC色譜圖見(jiàn)圖7～10，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 The determine results of sample

從圖7～10及表2中可以看出，經(jīng)過(guò)雙水相萃取，麗江山慈菇中的秋水仙堿主要集中于上相(PEG相)，下相中僅存留很少量的秋水仙堿。萃取液經(jīng)HPLC檢測(cè)，上相中秋水仙堿濃度為0.7496 mg/ mL，富集倍數(shù)為6.84倍，萃取率為82.09%。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，此方法用于麗江山慈菇粗提液中秋水仙堿的初步分離富集有效，為進(jìn)一步提高萃取率，可考慮在下相中加入PEG進(jìn)行二次萃取。秋水仙堿在雙水相體系中的分配機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文探討了PGE-(NH4)2SO4雙水相體系對(duì)秋水仙堿的萃取，對(duì)影響秋水仙堿萃取率的因素(PEG分子量、PEG的濃度、(NH4)2SO4的濃度和pH值)進(jìn)行了考查研究，確定了最佳萃取條件:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PEG6000和20%的(NH4)2SO4，pH=7.0對(duì)麗江山慈菇粗提液進(jìn)行雙水相萃取，萃取率為82.09%，富集倍數(shù)為6.84倍。本實(shí)驗(yàn)為生物堿類化合物萃取分離提供了一種有效方法。相比傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取等方法，此方法具有簡(jiǎn)單、萃取條件溫和、不使用有機(jī)溶劑，更加環(huán)保、可連續(xù)操作、安全方便等優(yōu)點(diǎn)。

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Extraction the Colchicine of Iphigenia indica in Aqueous Two-phase System

SHI Yao1，2，YANG Ya-ling1*，LI Wan-yi2，LIU Mou-sheng11Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China;2Medical Plant Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223，China

A new method to extract the colchicine of Iphigenia indica in aqueous two-phase system(ATPS)formed by macromolecular compound PEG6000 and(NH4)2SO4was investigated.The effect of the molecular weight of PEG，the concentration of PEG，the concentration of(NH4)2SO4and pH on phase behavior of the ATPS and extraction efficiencies of colchicines was investigated systematically.Determination the content of colchincine in the extraction phase combined with HPLC.The results showed that the best ATPS was composed of 8%PEG6000 and 20%(NH4)2SO4，pH 7.0.The extraction efficiency of colchicine of crude extract could reach to 82.09%，fold enrichment reach to 6.84.This method could be used to initial separate and enrichment the colchicine of Iphigenia indica，simple operation and friendly to the environment.

Iphigenia indica;colchicine;aqueous two-phase system;HPLC

1001-6880(2012)10-1412-05

2011-11-11 接受日期:2012-03-22

*通訊作者 Tel:86-013888316388;E-mail:yilyil8@163.com

R284.2

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