邱楠楠，劉金平，艾 民，李平亞*

1吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長春130021;2長春大學(xué)，長春130022

西洋參莖葉化學(xué)成分及生物利用度的研究

邱楠楠1，劉金平1，艾 民2，李平亞1*

1吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長春130021;2長春大學(xué)，長春130022

應(yīng)用多種色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，從西洋參莖葉中分離得到10個化合物，經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析鑒定分別為:擬人參皂苷RT4(1)、擬人參皂苷RT5(2)、24(R)-Ocotillol苷元(3)、20(S)-人參皂苷Rh1(4)、20 (S)-人參皂苷Rg1(5)、20(S)-人參皂苷Rg2(6)、20(S)-人參皂苷Rh2(7)、20(R)-人參皂苷Rh2(8)、20(S)-人參皂苷Rg3(9)、擬人參皂苷F11(10)?；衔?和3為首次從西洋參莖葉中分離得到。首次建立和認(rèn)證了20 (S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度的測定方法，采用本文方法測定犬肌注20(S)-人參皂苷Rg3的生物利用度為96.7%，為20(S)-人參皂苷Rg3的新藥開發(fā)提供了臨床前藥代動力學(xué)依據(jù)。

西洋參莖葉;化學(xué)成分;20(S)-人參皂苷Rg3;肌內(nèi)注射;生物利用度

西洋參(Panax quinquefolium L.)，為五加科人參屬多年生宿根草本植物，是聞名于世的珍貴藥用植物。其性寒涼、味微苦，具有益肺陰、清虛熱、生津止渴之功效。西洋參原產(chǎn)于北美洲的原始森林，我國自20世紀(jì)80年代起大面積引種并獲得成功。研究表明，西洋參的主要活性成份為四環(huán)三萜類皂苷［1］，并且皂苷類成分在西洋參莖葉部位的含量明顯高于根部，為了綜合利用西洋參資源，國內(nèi)外學(xué)者開始了對西洋參地上部分(莖、葉)的主要活性成份―西洋參莖葉皂苷的研究。本文從吉林省撫松產(chǎn)西洋參莖葉中提取分離得到了20(S)-人參皂苷Rg3等三萜皂苷類成分10種。

20(S)-人參皂苷Rg3具有抗癌生物活性［2-5］。李平亞，等［6］報道了20(S)-人參皂苷Rg3合成工藝成熟、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可控，在抗癌、抗病毒方面具有很強(qiáng)的生物活性，毒性較低，具備了良好的成藥性。劉繼華，等［7］發(fā)現(xiàn)20(S)-人參皂苷Rg3在臟器中的含量分布為肺＞脾＞心＞腎＞肝。有關(guān)20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度未見報道，因此，本實(shí)驗(yàn)首次采用Beagle犬的肌內(nèi)給藥和靜脈給藥不同給藥途徑對犬肌內(nèi)注射20(S)-人參皂苷Rg3的生物利用度進(jìn)行研究，為開發(fā)20(S)-人參皂苷Rg3創(chuàng)新藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

柱色譜硅膠(300～400目)、薄層色譜硅膠(GF254)均為青島海洋化工廠生產(chǎn)，所用試劑均為分析純;西洋參莖葉為吉林省撫松縣大自然生物工程有限公司惠贈;20(S)-人參皂苷Rg3自制，純度98.5%;Beagle犬由長春高新醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。

1.2 儀器

DRX-500型核磁共振儀，美國 Bruker公司生產(chǎn);XT4-100B顯微熔點(diǎn)測定儀，上海荊和分析儀器有限公司生產(chǎn);1525型高效液相色譜儀，美國Waters公司生產(chǎn);高效液相色譜儀LC-10ATVP，日本島津公司生產(chǎn);SEDEX 75蒸發(fā)光散射檢測器，法國生產(chǎn);N-2000色譜數(shù)據(jù)工作站，浙江大學(xué)智能信息工程研究所生產(chǎn);旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);800型離心沉淀器，上海手術(shù)器械廠生產(chǎn);分析天平，上海天平儀器廠生產(chǎn);KQ-50B型超生波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn);Strata C18-E固相萃取柱，法國迪馬公司生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取分離

取干西洋參莖葉2 kg，以70%的乙醇回流提取，提取液經(jīng)濃縮后，用氯仿萃取3次，合并提取液，回收溶劑得氯仿層(8 g)。水層經(jīng)大孔吸附樹脂柱，依次用水、70%乙醇、95%乙醇洗脫，分別收集洗脫液。70%乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮，真空干燥，得到156 g總皂苷?？傇碥战?jīng)反復(fù)硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇40∶1～1∶1進(jìn)行洗脫、分離。結(jié)合制備薄層、重結(jié)晶等方法得到化合物3(32 mg)和化合物10(27 mg);柱層析洗脫至10∶1，結(jié)合制備HPLC得到化合物4(120 mg)、化合物7(96 mg)和化合物8(50 mg);柱層析洗脫至8∶1，結(jié)合制備HPLC得到化合物1(12 mg)和化合物2(11.5 mg);柱層析洗脫至6∶1，結(jié)合制備HPLC得到化合物6(22 mg)，結(jié)合C-18反相柱層析，得到化合物5(16 mg)和化合物9 (31 mg)。

2.2 20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度研究

2.2.1 測定方法的建立和認(rèn)證

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《化學(xué)藥品臨床前藥代動力學(xué)研究指導(dǎo)原則》［8］研究“20(S)-人參皂苷Rg3”肌內(nèi)注射的生物利用度。采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC/ELSD)［9］進(jìn)行血漿樣品的測定。

2.2.1.1 犬血漿樣品處理方法

取犬血漿2 mL，加入甲醇8 mL，震蕩混勻，離心10 min(3000 rpm)，分取上清液，加蒸餾水10 mL，經(jīng)Strata固相萃取柱萃取，先以70%甲醇4 mL洗脫，再以甲醇2 mL洗脫，收集甲醇部分，于40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘渣?00 μL色譜甲醇溶解，吸取10 μL進(jìn)樣檢測。

2.2.1.2 特異性試驗(yàn)

取犬空白血漿2.0 mL，另取一份空白血漿加入一定量20(S)-人參皂苷Rg3及內(nèi)標(biāo)物Rh2對照品，并取給藥后犬血漿2.0 mL，照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，分別吸取10 μL，進(jìn)樣檢測。

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

配制20(S)-人參皂苷Rg3的甲醇溶液，其濃度分別為50、100、300、600、1200 ng/mL，內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rh2的濃度為600 ng/mL，分別吸取各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0 mL，N2氣下?lián)]干甲醇，殘渣加入色譜甲醇100 μL，吸取10 μL，依照高效液相色譜法測定。系統(tǒng)條件:ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm);流動相:甲醇—水(86.5∶13.5);流速:1.0 mL/min;檢測器:蒸發(fā)光散射檢測器，霧化室溫度:50℃;靈敏度為10;載氣:N2，壓力:3.4 Bar。

2.2.1.4 犬血漿樣品測定的校正工作曲線

準(zhǔn)確吸取20(S)-人參皂苷Rg3的對照品溶液和人參皂苷Rh2的對照品溶液一定量，于N2下?lián)]干甲醇，加入空白犬血漿2.0 mL，制成含20(S)-人參皂苷Rg3的濃度為50、100、300、600、1200ng/mL，內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rh2濃度為600 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，照“犬血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，殘渣加色譜甲醇100 μL溶解，吸取10 μL進(jìn)樣檢測。

2.2.1.5 精密度、穩(wěn)定性與回收率實(shí)驗(yàn)

取犬空白血漿2.0 mL，加入20(S)-人參皂苷Rg3對照品，使其濃度分別為80、200、1000 ng/mL;內(nèi)標(biāo)物人參皂苷Rh2對照品，使其濃度為600 ng/ mL，照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)行日內(nèi)精密度、日間精密度、穩(wěn)定性和回收率實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 犬肌注20(S)-人參皂苷Rg3的生物利用度研究

2.2.2.1 肌內(nèi)注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定

犬5條，分別肌注20(S)-人參皂苷Rg30.5 mg/ kg，并于給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h從前腿靜脈取血5 mL，置含有肝素的塑料離心管中，離心10 min(3000 rpm)，取血漿樣品2 mL進(jìn)行檢測。

2.2.2.2 靜脈注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定

犬5條，分別靜脈注射20(S)-人參皂苷Rg30.5 mg/kg，并于給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h從前腿靜脈取血5 mL，置含有肝素的塑料離心管中，離心10 min(3000 rpm)，取血漿樣品2 mL進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末(MeOH)，易溶于甲醇、乙醇。TLC檢測，10%硫酸乙醇溶液顯紫色。Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陽性。10%硫酸水解檢出葡萄糖;50%醋酸部分水解未檢出糖。1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ:2.08(3H，s)，1.62 (3H，s)，1.45(3H，s)，1.31(3H，s)，1.27(3H，s)，1.22(3H，s)，1.06(3H，s)，0.76(3H，s)為甲基質(zhì)子信號，δ5.05(1H，d，J=7.5Hz)為糖端基質(zhì)子信號。13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ:39.54(C-1)，27.99 (C-2)，78.29(C-3)，40.44(C-4)，61.57(C-5)，78.60(C-6)，45.13(C-7)，41.05(C-8)，50.38(C-9)，39.67(C-10)，32.54(C-11)，70.88(C-12)，49.14(C-13)，52.24(C-14)，31.73(C-15)，25.80 (C-16)，49.50(C-17)，17.79(C-18)，17.20(C-19)，87.09(C-20)，27.01(C-21)，32.71(C-22)，28.70 (C-23)，88.45(C-24)，70.02(C-25)，26.60(C-26)，29.02(C-27)，32.22(C-28)，16.36(C-29)，17.91 (C-30)，106.07(C-6-glc-1')，75.49(C-6-glc-2')，80.19(C-6-glc-3')，71.86(C-6-glc-4')，79.74(C-6-glc-5')，63.11(C-6-glc-6')。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道的擬人參皂苷RT4數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為擬人參皂苷RT4。

化合物3 無色針晶(MeOH)，mp.211～213℃，易溶于甲醇、乙醇。TLC檢測，10%硫酸乙醇溶液顯紫色，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陰性。1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ:0.90(3H，s)，0.95(3H，s)，1.10(3H，s)，1.25(3H，s)，1.25(3H，s)，1.42(3H，s)，1.46(3H，s)，1.97(3H，s)為甲基質(zhì)子信號。4個連氧碳上的氫質(zhì)子信號:δ3.50(1H，dd，J=11.5，5.0 Hz)，3.71(1H，dt，J=10.5，5.0 Hz)，3.94(1H，dd，J=8.5，7.0 Hz)，4.40(1H，m)。13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ:39.42(C-1)，28.11(C-2)，78.41(C-3)，40.39(C-4)，61.94(C-5)，67.73(C-6)，47.46(C-7)，41.12(C-8)，50.47 (C-9)，39.26(C-10)，32.45(C-11)，71.19(C-12)，49.42(C-13)，52.14(C-14)，31.82(C-15)，28.80 (C-16)，48.37(C-17)，17.16(C-18)，17.77(C-19)，86.72(C-20)，26.98(C-21)，31.71(C-22)，25.48 (C-23)，85.63(C-24)，70.37(C-25)，27.13(C-26)，27.62(C-27)，31.91(C-28)，16.47(C-29)，18.33 (C-30)。其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報道的24(R)-Ocotillol苷元數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為24(R)-Ocotillol苷元。

3.2 20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度的測定方法的建立和認(rèn)定結(jié)果

3.2.1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，血漿中待測物為原形藥物，并且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾檢測，20(S)-人參皂苷Rg3的保留時間為11.0 min左右，Rh2的保留時間為22.9 min左右，對照品前后均無雜質(zhì)峰干擾。結(jié)果分別見圖1～3。最低檢測限度為50 ng/mL。

圖3 加入Rg3、Rh2對照品的犬血漿樣品圖譜Fig.3 The blank dogs plasma spiked with ginsenoside Rg3and Rh2

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制結(jié)果

以20(S)-人參皂苷Rg3濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以20(S)-人參皂苷Rg3和Rh2峰面積的對數(shù)之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程為:y=0.4612+0.1923x，r=0.997。結(jié)果表明，20(S)-人參皂苷Rg3在50～1200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限度為50 ng/mL。

3.2.3 犬血漿樣品測定的校正工作曲線繪制結(jié)果

以20(S)-人參皂苷Rg3濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以20(S)-人參皂苷Rg3和Rh2峰面積的對數(shù)之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程為:Y=0.5048+0.1905X，r=0.996。結(jié)果表明，20(S)-人參皂苷Rg3在濃度為50～1200 ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，最低檢測限為50 ng/mL。

3.2.4 精密度、穩(wěn)定性與回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密度、穩(wěn)定性與回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法的日內(nèi)精密度，日間精密度和回收率均符合要求，儀器的穩(wěn)定性也符合要求。結(jié)果見表1。

表1 精密度、回收率與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision，recovery and stability test of ginsenoside Rg3in dogs plasma

總之，采用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC/ELSD)［13］對血漿樣品進(jìn)行測定，該方法經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(校正曲線)制備，方法學(xué)認(rèn)證考察，表明該方法符合新藥藥代動力學(xué)試驗(yàn)的技術(shù)要求。

3.3 犬肌注20(S)-人參皂苷Rg3的生物利用度研究結(jié)果

3.3.1 肌內(nèi)注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定結(jié)果

通過犬肌內(nèi)注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定結(jié)果，繪制犬肌內(nèi)給藥后的血藥濃度—時間曲線，見圖4。

圖4 犬肌注給藥后的血藥濃度-時間曲線Fig.4 The plasma concentration versus time curve after dogs were intramuscular injection given 20(S)-ginsenoside-Rg3

3.3.2 犬肌注給藥的藥代動力學(xué)參數(shù)

將肌注給藥后各個時間點(diǎn)的血藥濃度測定主數(shù)據(jù)經(jīng)“3P87”藥代動力學(xué)程序擬合，判斷肌注給藥后，20(S)-人參皂苷Rg3在犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)模型為一室模型。藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表2。

表2 犬肌注給藥的藥代動力學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of dogs were intramuscular injection given 20(S)-ginsenoside-Rg3

3.3.3 靜脈注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定結(jié)果

通過犬靜脈注射20(S)-人參皂苷Rg3的血藥濃度測定結(jié)果，繪制犬靜脈注射后的血藥濃度—時間曲線，見圖5。

圖5 犬靜脈注射給藥后的血藥濃度-時間曲線Fig.5 The plasma concentration versus time curve after dogs were intravenous injection given 20(S)-ginsenoside-Rg3

3.3.4 犬靜脈注射給藥的藥代動力學(xué)參數(shù)

將靜注給藥后各個時間點(diǎn)的血藥濃度測定主數(shù)據(jù)經(jīng)“3P87”藥代動力學(xué)程序擬合，判斷靜注給藥后，20(S)-人參皂苷Rg3在犬體內(nèi)的藥代動力學(xué)模型為一室模型。藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表7。

表3 犬靜注給藥的藥代動力學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of dogs were intravenous injection given 20(S)-ginsenoside-Rg3

本實(shí)驗(yàn)對犬給藥進(jìn)行20(S)-人參皂苷Rg3的生物利用度研究中，其藥代動力學(xué)特征可歸納如下:犬肌注人參皂苷20(S)-人參皂苷Rg30.5 mg/kg后，血藥濃度—時間曲線測定主數(shù)據(jù)經(jīng)“3P87”藥代動力學(xué)程序擬合，結(jié)果表明其藥代動力學(xué)模型均為一室模型。其藥代動力學(xué)參數(shù)為:T1/2(ke)為0.455 h，T(peak)為0.779 h，C(max)為519.1 ng/mL，AUC為1594.2 h·ng/mL;犬靜注20(S)-人參皂苷Rg30.5 mg/kg后，血藥濃度—時間曲線測定主數(shù)據(jù)經(jīng)“3P87”藥代動力學(xué)程序擬合，結(jié)果表明其藥代動力學(xué)模型均為一室模型。其藥代動力學(xué)參數(shù)為:T1/2(ke)為 1.557 h，V(c)為 0.00136 L/kg，CL為0.000607 L/(kg·h)，AUC為1648.1 h·ng/mL。犬肌注20(S)-人參皂苷 Rg3的生物利用度為96.7%。證明20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度較高，肌內(nèi)注射是合適的給藥途徑。

4 結(jié)論

本文通過對西洋參莖葉進(jìn)行提取分離，得到10個化合物。鑒定分別為:擬人參皂苷RT4(1)、擬人參皂苷RT5(2)、24(R)-Ocotillol苷元(3)、20(S)-人參皂苷Rh1(4)、20(S)-人參皂苷Rg1(5)、20(S)-人參皂苷Rg2(6)、20(S)-人參皂苷Rh2(7)、20(R)-人參皂苷Rh2(8)、20(S)-人參皂苷Rg3(9)、擬人參皂苷F11(10)?；衔?和3為首次從西洋參莖葉中分離得到。

首次建立和認(rèn)證了20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度的測定方法。首次利用犬的肌內(nèi)注射和靜脈注射的模型，研究了20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度。證明20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射的生物利用度較高，肌內(nèi)注射是合適的給藥途徑。為開發(fā)20(S)-人參皂苷Rg3肌內(nèi)注射劑提供了科學(xué)依據(jù)。

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Chemical Constituents and Bioavailability of Saponins from the Leaves and Stems of Panax quinquefolium L.

QIU Nan-nan1，LIU Jin-ping1，AI Min2，LI Ping-ya1*1Institute of Frontier Medical Science of Jilin University，Changchun 130021，China;2Chang Chun University，Changchun 130022，China

Ten compounds were isolated from saponins from the leaves and stems of Panax quinquefolium L.by various column ehromatographic techniques.They were elucidated on the basis of physicochemical property and spectral data (TLC，1H and13C NMR).They were determined as psuedo-ginsenoside-RT4(1)，psuedo-ginsenoside-RT5(2)，24(R)-Ocotillol(3)，20(S)-ginsenoside-Rh1(4)，20(S)-ginsenoside-Rg1(5)，20(S)-ginsenoside-Rg2(6)，20(S)-ginsenoside-Rh2(7)，20(R)-ginsenoside-Rh2(8)，20(S)-ginsenoside-Rg3(9)and psuedo-ginsenoside-PF11(10).Compounds 1 and 3 were extracted and separated from the leaves and stems of Panax quinquefolium L.for the first time.The bioavailability of intramuscular 20(S)-ginsenoside-Rg3in dogs were determined and certificated for the first time.In this way，the bioavailability of intramuscular 20(S)-ginsenoside-Rg3in dogs was determined，which was 96.7%.The results provided the preclinical pharmacokinetics basis for the research and development of 20(S)-ginsenoside-Rg3injection.

Panax quinquefolium saponins from leaves and stems;isolation;20(S)-ginsenoside-Rg3;intramuscular injection;bioavailability

1001-6880(2012)10-1393-06

2011-11-11 接受日期:2012-03-08

*通訊作者 Tel:86-431-85619803;E-mail:lipy@jlu.edu.cn

R284.1;Q946

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