葛 夢(mèng)，喻衛(wèi)武，周明兵，王同標(biāo)，楊 萍*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；3.浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)院橋楊梅良種場，浙江 臺(tái)州 318025）

楊梅（Myrica rubra）特產(chǎn)于中國，主要分布在長江流域以南，海南省以北的山地。浙江、江蘇、福建、湖南、江西、廣東等省都將其作為重要果樹種植，其中以浙江省栽培面積最廣且品質(zhì)最佳[1]。目前，浙江楊梅栽培種主要以東魁、荸薺種、晚稻楊梅、丁岙梅這四大傳統(tǒng)良種為主，同時(shí)近年來又從自然變異中選育出早薺蜜梅、晚薺蜜梅等新品種[2～3]。雖然這些楊梅品種在果實(shí)品質(zhì)、熟期、葉形、植株形態(tài)等性狀上有著一定的差異，可以通過農(nóng)藝性狀的比較進(jìn)行區(qū)分[4]，但僅從農(nóng)藝性狀上無法了解其分子水平上的遺傳差異程度。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)在研究楊梅親緣關(guān)系和遺傳多樣性上應(yīng)用廣泛[5～11]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）標(biāo)記是Li等[12]提出的利用特定引物對(duì)ORFs區(qū)域（Open Reading Frames）進(jìn)行擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記，與其它標(biāo)記比較，其結(jié)合了大多數(shù)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：在基因組中分布均勻，簡便、穩(wěn)定、效率較高，是遺傳多樣性和圖譜構(gòu)建等研究較理想的標(biāo)記[13]。目前已被應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性研究[14～15]，但在楊梅的研究中尚未見報(bào)道。

本文采用SRAP標(biāo)記技術(shù)評(píng)價(jià)9個(gè)浙江主栽楊梅品種的遺傳多樣性，以期為楊梅分類和雜交育種的親本選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以浙江省主要栽培的9個(gè)楊梅品種為試驗(yàn)材料（表1），于2011年5月取自臺(tái)州市黃巖區(qū)院橋楊梅良種苗圃。采取各品種生長健壯、無病蟲害的嫩葉，于實(shí)驗(yàn)室－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)材料Table1 Materials used in the study

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用改進(jìn)的 CTAB法提取楊梅基因組DNA[16]，DNA用TE溶解，經(jīng)紫外分光光度計(jì)、0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度。將經(jīng)檢驗(yàn)合格的DNA樣品定量至100 ng/μL，于－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP分析 引物采用Li等[12]發(fā)表的引物（表2），由上海Sangon合成。PCR反應(yīng)體系如下：在20 μL體積中，含60 ng模板DNA；正、反向引物各10 mmol/L；0.2 mol/L dNTPs；2 mmol/L MgCl2；1U Taq DNA聚合酶；1×PCR反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1min，72℃復(fù)性1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃復(fù)性1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃結(jié)束保存。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

表2 SRAP分析所用引物及其序列Table2 The sequence and primers of SRAP

1.3 數(shù)據(jù)處理

讀取電泳條帶，按每個(gè)樣品電泳條帶有或無記錄，條帶存在時(shí)賦值為1，無條帶賦值為0。根據(jù)Nei-Li相似系數(shù)法分別計(jì)算各個(gè)品種間的遺傳相似性系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD, GD = 1－GS），聚類用不加權(quán)組平均法進(jìn)行。用NTSYS-pc軟件按照Nei-Li進(jìn)行作圖，對(duì)得到的遺傳相似性系數(shù)矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP多態(tài)性分析

通過8個(gè)正向引物和10個(gè)反向引物組成的80個(gè)引物組合對(duì)供試楊梅品種的DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，從中篩選了24對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物組合。利用這24對(duì)SRAP引物對(duì)9個(gè)楊梅品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。圖1為引物組合ME6＋EM2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3。從表3中可以看到，24對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增得到157條條帶，其中多態(tài)性條帶121條，平均每對(duì)引物產(chǎn)生6.54條條帶和5.04條多態(tài)性條帶。不同的引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶的百分率相差較大，從33.33%到100%不等，平均為75.98%。同時(shí)，不同引物組合檢測到的SRAP標(biāo)記的等位變異數(shù)不同，ME8＋EM3在供試材料中僅檢測到2種等位變異，而ME1＋EM1、ME4＋EM5和 ME5＋EM10檢測到最多的等位變異數(shù)（8種），平均每個(gè)引物組合檢測到5.33種等位變異。此外，由表3可知，不同引物組合的多態(tài)信息含量（PIC）各不相同，24個(gè)引物組合的PIC值為0.423 5 ～ 0.856 4，平均0.668 9。

圖1 引物組合ME6＋EM2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure1 PCR products from primers ME6 +EM2 by agarose gelelectrophoresis

表3 SRAP引物組合及擴(kuò)增結(jié)果Table3 SRAP primer combinations and amplified bands

2.2 遺傳距離和聚類分析

根據(jù)遺傳相似表（表4），9個(gè)樣品的遺傳系數(shù)為0.523 2 ～ 0.860 9，表明各個(gè)樣本之間存在著較為廣泛的遺傳多樣性，品種間的變異較為豐富。其中親緣關(guān)系最近的是早薺蜜梅和晚薺蜜梅以及黑晶和黃巖水梅，最遠(yuǎn)的是晚稻楊梅和黃巖水梅。

根據(jù)UPGMA聚類的結(jié)果（圖2），在遺傳相似系數(shù)為0.77時(shí)，可將9個(gè)楊梅品種分為3類。其中黃巖水梅、黑晶、早薺蜜梅、晚薺蜜梅、早大梅、東魁聚為一類；其余樣品均單獨(dú)聚為一類。浙江省的傳統(tǒng)4大良種——東魁、荸薺種、丁岙梅、晚稻楊梅分別位于不同的大類中。

圖2 9個(gè)楊梅品種聚類圖Figure2 Dendrogram of 9 M.rubra cultivars

表4 9個(gè)楊梅材料的遺傳相似表Table4 Genetic similarity matrix of 9 Myrica rubra cultivars based on SRAP

3 結(jié)論

本文采用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)9個(gè)浙江主栽的楊梅品種進(jìn)行遺傳差異研究，從80對(duì)引物中篩選出24對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。共擴(kuò)增出157個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)121個(gè)，從分子水平基本反映了這些品種的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度，證實(shí)了浙江楊梅主栽品種具有比較豐富的遺傳多樣性，該結(jié)果可以為楊梅分類、雜交育種研究的親本選擇等提供參考依據(jù)。

4 討 論

4.1 供試樣品間的遺傳關(guān)系與新品種選育

本研究利用24對(duì)SRAP引物對(duì)浙江省主要的9個(gè)楊梅品種進(jìn)行遺傳差異研究，其遺傳系數(shù)為0.523 2 ～ 0.860 9，各對(duì)引物的多態(tài)信息含量（PIC）平均達(dá)到0.738 4，表明9個(gè)楊梅品種間存在比較豐富的遺傳差異，這與前人用RAPD、ISSR等標(biāo)記得到的結(jié)果類似[6,10]。

SRAP聚類分析表明供試楊梅材料的遺傳相似程度與原產(chǎn)地地理分布相關(guān)。供試樣品中東魁、荸薺種、晚稻楊梅和丁岙梅是浙江省主要栽培的四大傳統(tǒng)良種[4]，栽培歷史悠久，并各自分屬于臺(tái)州黃巖、寧波慈溪、舟山定海和溫州甌海的地方品種，原產(chǎn)地的地理分布相對(duì)獨(dú)立。在用UPGMA方法聚類時(shí)，于遺傳相似系數(shù)0.80處，均被歸為不同的類，這與林伯年等[7]利用ISSR標(biāo)記和張水明[11]利用SSR標(biāo)記分析得到的結(jié)果相符。黃巖水梅、黑晶、早大梅、東魁均是臺(tái)州地區(qū)的品種[4]，在聚類圖中集中分布，遺傳距離比較近。早薺蜜梅和晚薺蜜梅都是由荸薺種中選育的良種，在聚類圖上兩者的遺傳距離非常近，但與荸薺種的遺傳距離較遠(yuǎn)，甚至位于不同的大組中；張水明利用SSR標(biāo)記得到的結(jié)果也顯示早薺蜜梅、晚薺蜜梅和荸薺種楊梅的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，并認(rèn)為可能由于他們變異的來源不同導(dǎo)致：早薺蜜梅為荸薺種的實(shí)生早熟變異，晚薺蜜梅為荸薺種的晚熟營養(yǎng)系變異[11]。

根據(jù)遺傳相似系數(shù)和聚類得到的結(jié)果，在進(jìn)行楊梅雜交育種時(shí)可根據(jù)育種目標(biāo)選擇具有不同優(yōu)良性狀且遺傳差異較大的品種作為父母本。

4.2 SRAP在楊梅中的可行性分析

24對(duì)多態(tài)性引物共擴(kuò)增出121條多態(tài)性條帶，平均5.08條，且單引物最多能產(chǎn)生8條多態(tài)性條帶，這與M Ferriol等[14]在甜瓜、林忠旭等[15]在棉花研究中得到的結(jié)果相當(dāng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示SRAP在楊梅中擴(kuò)增得到的條帶清晰，產(chǎn)率較高，可以在楊梅中產(chǎn)生較好的多態(tài)性。

SRAP擴(kuò)增ORFs區(qū)域是基因序列的重要組成部分，也是產(chǎn)生不同品種間差異的重要因素[17]。SRAP技術(shù)在育種目標(biāo)性狀的評(píng)價(jià)方面明顯優(yōu)于RAPD標(biāo)記[18]，有較高的多態(tài)性標(biāo)記比率[15]，是一個(gè)評(píng)價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生的有效工具[19]。本研究結(jié)果顯示SRAP標(biāo)記的聚類結(jié)果與品種來源的地域基本吻合，說明利用SRAP標(biāo)記評(píng)價(jià)楊梅品種的遺傳多樣性是可行的，并且可以通過擴(kuò)大引物對(duì)數(shù)和供試楊梅品種數(shù)，在分子水平上為楊梅各品種的指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源的鑒定、篩選和利用等提供理論依據(jù)。

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