劉 饒，蔣燕鋒，許元科，毛昌會

（1.浙江省景寧縣科技開發(fā)服務(wù)部，浙江 景寧 323500；2.浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000；3.浙江省景寧縣林業(yè)局，浙江 景寧 323500）

景寧木蘭（Magnolia sinostellata）是1984年發(fā)現(xiàn)、1989年定名的木蘭屬新種[1～2]。在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)景寧木蘭座果率和種子產(chǎn)量不高，嚴(yán)重影響了該珍稀瀕危植物的大范圍栽培和開發(fā)利用。植物受精成敗受花粉活力、柱頭生活力和環(huán)境溫度、濕度等影響?；ǚ凼沁z傳信息的載體，是自然條件下種子植物遺傳信息交流的工具，其生活力直接影響植物授粉受精乃至座果[3]。其活力測定結(jié)果的準(zhǔn)確性決定細(xì)胞學(xué)實驗和雜交育種的成敗，可為植物推廣種植時授粉品種的遴選及生產(chǎn)中制定花期噴硼的促果技術(shù)提供依據(jù)。因此，花粉生活力測定方法及測定標(biāo)準(zhǔn)一直是育種關(guān)注的問題。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為景寧木蘭花粉，在景寧木蘭花苞半開放期，選取樹冠中上部陽面的健康花枝，在室內(nèi)進(jìn)行水培，待其花粉自然成熟時收集，于4℃的冰箱及室溫下保存，備用。

1.2 實驗方法

采用TTC法、過氧化物酶測定法及花粉發(fā)芽法測定景寧木蘭花粉活力。TTC法、過氧化物酶測定法均觀察3個制片，每片取3個視野；花粉發(fā)芽法每個處理觀察3個視野，每個視野觀察100粒?；ǚ勖劝l(fā)以其花粉管伸長超過花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計花粉發(fā)芽率，取平均值為結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 景寧木蘭花粉活力測定方法確定

利用TTC法進(jìn)行花粉生活力的測定具有快速簡便的特點，但是受到花粉自身因素的影響較大，例如花粉壁薄厚，花粉外壁的組成物質(zhì)，花粉內(nèi)各種酶活性等。因此，不同的染色方法只適合于某些植物花粉生活力的測定，不同的染色劑對同一品種的花粉染色率是不同的。景寧木蘭花粉經(jīng)0.5%TTC溶液染色之后，顯現(xiàn)出淡紅色居多。但是其顏色穩(wěn)定性較差，染色效果不理想，并且有生活力和無生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不適合用于景寧木蘭花粉生活力的測定。

試驗中也觀察到過氧化物酶測定法測定景寧木蘭花粉生活力的效果不明顯，其測定結(jié)果相對于花粉發(fā)芽法明顯偏高。因此，進(jìn)一步試驗均以花粉離體培養(yǎng)法進(jìn)行。

2.2 花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)法測定景寧木蘭花粉活力

2.2.1 最適宜觀測時期的確定 在景寧木蘭花粉萌發(fā)速度和伸長速度達(dá)到穩(wěn)定時進(jìn)行花粉生活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計可以使統(tǒng)計數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。為了探索景寧木蘭花粉萌發(fā)速度及花粉管伸長速度達(dá)到穩(wěn)定的時間點，本試驗對其離體萌發(fā)情況進(jìn)行了跟蹤測定。結(jié)果表明，景寧木蘭花粉培養(yǎng)2 h就開始萌發(fā)，10 h萌發(fā)率上升到了68.22%，其后萌發(fā)率緩慢增加，14 h達(dá)到了78.25%；14 ～ 16 h萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，花粉萌發(fā)逐漸停止。由此可見，進(jìn)行花粉萌發(fā)率測定的最適合時間點是培養(yǎng)12 h以后。景寧木蘭花粉培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下已可清晰辨認(rèn)，14 h后彼此相互交錯延伸，使花粉粒的統(tǒng)計變得越來越困難。所以，綜合萌發(fā)率和伸長速度的變化情況，以花粉管培養(yǎng)14 h內(nèi)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計最合適。

2.2.2 不同蔗糖濃度對景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響 蔗糖對景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響見表1。從表中可以看出，景寧木蘭花粉的萌發(fā)對培養(yǎng)基中的蔗糖濃度有較為嚴(yán)格的要求，有明顯的域值效應(yīng)。萌發(fā)率從高到低依次為蔗糖濃度5%，0%，10%，15%，20%。蔗糖濃度以5%時最為適宜，此時景寧木蘭花粉的萌發(fā)率高達(dá)93.96%；低于5%的蔗糖濃度花粉萌發(fā)率與5%較為接近；然而蔗糖濃度 15%時反而不利于花粉的萌發(fā)，其萌發(fā)率降為17.41%；蔗糖濃度為20%時，花粉出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，花粉不能萌發(fā)。

經(jīng)方差分析表明，不同蔗糖濃度對景寧木蘭花粉萌發(fā)率的影響差異顯著，且花粉萌發(fā)率在蔗糖濃度5%時極顯著高于其他4個濃度。該結(jié)果表明，蔗糖濃度過高時會抑制花粉的萌發(fā)，5%的蔗糖濃度對景寧木蘭花粉的離體培養(yǎng)較為適宜。

2.2.3 不同硼酸濃度對景寧木蘭花粉萌發(fā)的影響 硼酸可增加氧的吸收以及促進(jìn)糖的吸收和代謝，利于果膠的合成，因而對花粉的萌發(fā)起促進(jìn)作用。表2結(jié)果顯示，加入少量硼酸能夠提高花粉的萌發(fā)率。隨著硼酸濃度的增加，花粉的萌發(fā)率有所上升，當(dāng)硼酸的濃度為 0.01%時，花粉的萌發(fā)率最高，達(dá)到86.64%。之后隨硼酸濃度的增加，花粉的萌發(fā)率顯著下降。由此可見，過量的外源硼對景寧木蘭花粉的萌發(fā)有抑制作用。

方差分析表明，不同硼酸濃度對景寧木蘭花粉萌發(fā)率的影響差異顯著，且花粉萌發(fā)率在硼酸濃度 0.01%時極顯著高于其他濃度。0%和0.03%硼酸濃度下萌發(fā)率差異不顯著，該結(jié)果表明，低濃度的硼酸培養(yǎng)基有利于花粉的萌發(fā)，硼酸濃度過高時反而會抑制花粉的萌發(fā)，0.01%的硼酸濃度對景寧木蘭花粉的離體培養(yǎng)較為適宜。

表1 不同蔗糖濃度下景寧木蘭花粉的萌發(fā)率Table1 Pollen germination rate of M.sinostellata with different sucrose concentration%

表2 不同硼酸濃度下景寧木蘭花粉的萌發(fā)率Table2 Pollen germination rate of M.sinostellata with different borax concentration%

2.3 溫度與儲藏時間對花粉生活力的影響

一般來說花粉的生活力會隨著貯藏時間的增加而降低，不同的貯藏方法在保持花粉生活力方面會有所不同。為此對采集的景寧木蘭花粉在室內(nèi)常溫貯藏和4℃冰箱冷藏保存條件下進(jìn)行了生活力觀察。

表3結(jié)果顯示，4℃低溫下儲藏的景寧木蘭花粉，其花粉發(fā)芽率高于室溫下儲藏的花粉。常溫下，花粉在第16 ～ 20 d時，就基本上喪失了活力，而在4℃低溫下，花粉的活力延長到了26 ～ 30 d，低溫儲藏10 d內(nèi)，花粉活力≥75%。景寧木蘭花粉無論是在常溫還是 4℃低溫條件下，從采集花粉的當(dāng)天開始，花粉活力就開始下降。景寧木蘭花粉在采集后的幾天內(nèi)，由于花粉剛脫離母體，失去了水分、營養(yǎng)等供應(yīng)，貯藏的最初10 d內(nèi)活力下降較快。室內(nèi)常溫貯藏10 d，其活力由93.95%下降到28.29%，每天下降6.57百分點；4℃冰箱冷藏保存10 d，花粉生活力由93.95%下降到78.55%，日平均下降 1.54百分點。實驗結(jié)果表明，溫度對景寧木蘭的花粉活力有影響，4℃低溫確實能使景寧木蘭的花粉保持相對較高的活力，但是所能延長的時間并不久。

表3 不同溫度和儲藏時間對花粉發(fā)芽率的影響Table3 Effect of different temperature and storage duration on pollen germination rate%

3 討論

3.1 TTC法和過氧化物酶測定法不適合景寧木蘭花粉生活力測定

通過對測定結(jié)果的分析認(rèn)為，TTC法測定景寧木蘭花粉時其顏色穩(wěn)定性較差，染色效果不理想，并且有生活力和無生活力的染色界限不分明，表明TTC染色法不適合用于景寧木蘭花粉生活力的測定。過氧化物酶測定法測定景寧木蘭花粉生活力的效果也不明顯，測定結(jié)果相對于花粉發(fā)芽法明顯偏高。

3.2 適宜的硼酸濃度可以促進(jìn)花粉萌發(fā)

硼酸對于花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長有一定的促進(jìn)作用，是花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的主要成分[4]。Jackson等人在以矮牽牛為試材的研究中也發(fā)現(xiàn)，在花粉管生長過程中，培養(yǎng)基內(nèi)有硼酸時，有利于更多的蛋白質(zhì)組裝成膜和壁的成分，而膜和壁是花粉管生長的必須成分，因而有利于花粉管的生長。迄今有關(guān)硼酸對花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究均認(rèn)為，一定濃度的硼酸有利于花粉萌發(fā)和花粉管的生長[5]。但不同植物種類的花粉萌發(fā)和生長所需的最適硼酸濃度不同。研究結(jié)果表明，在添加硼酸的培養(yǎng)基內(nèi)景寧木蘭花粉萌發(fā)和花粉管生長均有所提高，但高濃度則起抑制作用，其最佳濃度為0.01%。

3.3 適宜的蔗糖濃度可以促進(jìn)花粉萌發(fā)

蔗糖對花粉的萌發(fā)具有兩方面作用，一是為花粉的萌發(fā)及花粉管的生長提供營養(yǎng)，二是維持外界環(huán)境一定的滲透壓。蔗糖能進(jìn)入花粉并增大細(xì)胞內(nèi)已很高的內(nèi)源濃度。所以，高濃度的蔗糖能改變花粉管的透性，導(dǎo)致代謝物和離子泄露在培養(yǎng)基里，反而對萌發(fā)不利。實驗結(jié)果也表明了一樣的結(jié)果，供試景寧木蘭花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而升高，在濃度為5%時，萌發(fā)率最高，大于5%時，萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增大而降低，蔗糖濃度15%時其萌發(fā)率降為19.55%，蔗糖濃度為20%時，花粉出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，花粉不能萌發(fā)。

3.4 適當(dāng)?shù)牡蜏刭A藏可以延長景寧木蘭花粉的壽命

試驗結(jié)果表明，4℃低溫不僅能使花粉保持較高活力，還可以有效延長花粉的保存時間。常溫下景寧木蘭的花粉生命力下降極快，保存16 ～ 20 d就幾乎全部喪失生命力。而4℃低溫使得花粉的壽命延長到26 ～ 30 d。

[1]裘寶林，陳征海.浙江木蘭屬新種[J].植物分類學(xué)報，1989，27（1）：79－80.

[2]斯金平，蔡通愛.珍稀瀕危植物景寧木蘭[J].浙江林業(yè)科技，1998，18（1）：68－71.

[3]王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定[J].植物學(xué)通報，2002，19（3）：365－373.

[4]胡晉.花粉的保存和生活力測定[J].種子，1992（6）：33－36.

[5]符碧.尿素和硼及生長調(diào)節(jié)劑對荔枝花粉萌發(fā)與生長的影響[J].云南師范大學(xué)學(xué)報，2001（3）：62－65.