鄧德耀，袁文麗，馮 倩，劉春林，趙東巖，李顯麗，高宗鷹，徐紅云，方 芳，李奕平

（云南省第二人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.內(nèi)分泌科，云南 昆明650021）

過(guò)氧化物增殖激活受體協(xié)同激活子（PPAR－γ coactivator 1α，PGC－1α）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活子，在多種糖尿病研究模型及部分人種中可見(jiàn)其多態(tài)性與2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）相關(guān)，認(rèn)為PGC－1α可能參與了糖尿病發(fā)病［1－4］。糖尿病前期又 稱(chēng)糖調(diào)節(jié)受損（Impaired glucose regulation，IGR）是指血糖處于正常與糖尿病之間的時(shí)期，包括空腹血糖受損（Impaired free glucose，IFG）和糖耐量受損（Impaired glucose tolerance，IGT）以及兩者合并存在三種狀態(tài)［5］。在T2DM被確診以前，患者都要經(jīng)歷糖尿病前期階段?；颊咴谶@一階段發(fā)展成為糖尿病的可能性明顯提高，并且出現(xiàn)大血管和微血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)明顯升高，是糖尿病自然病程的重要階段，也是預(yù)測(cè)糖尿病的臨床標(biāo)志。然而，大規(guī)模流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)并非所有的糖尿病前期人群均進(jìn)展為2型糖尿病。因此本研究首次應(yīng)用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）方法，完成了對(duì)云南省昆明地區(qū)361例糖尿病前期人群PGC－1α基因Gly482Se多態(tài)性位點(diǎn)（rs8192678）進(jìn)行分析，在基因水平為預(yù)測(cè)糖尿病前期人群向糖尿病的轉(zhuǎn)歸提供了客觀依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選擇了云南省昆明地區(qū)的具有醫(yī)療記錄的361例糖尿病前期人群（IGR）、430例2型糖尿病患者（T2DM）和446例性別和年齡相匹配的OGTT正常的健康志愿者（NGT）。糖尿病及糖尿病前期診斷標(biāo)準(zhǔn)采用WHO1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)科學(xué)第7版）。正常對(duì)照系進(jìn)行糖尿病普查和篩選的隨機(jī)人群中確定的非糖尿病個(gè)體，無(wú)直接血緣關(guān)系且無(wú)糖尿病家族史。

1.2 主要試制和儀器

紫外分光光度計(jì) （Becman公司），PCR擴(kuò)增儀（Perkin－Elmer公司），DYY－10C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO－RED公司），LightCycler 480熒光定量分析儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司），即用PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物工程有限公司），LightCycler 480高分辨率熔解擴(kuò)增試劑盒（德國(guó)羅氏診斷有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）臨床資料收集：所有研究對(duì)象采用統(tǒng)一調(diào)查表進(jìn)行調(diào)查，內(nèi)容包括一般情況、個(gè)人史、家族史、吸煙飲酒史以及藥物使用情況等。每個(gè)個(gè)體均測(cè)量身高、體重、腰圍、臀圍，根據(jù)如下公式計(jì)算體重指數(shù)（BMI）：BMI＝體重／身高2（kg／m2）。血糖、血脂、肝腎功等均使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

（2）基因組DNA制備：用2%EDTA＋K2抗凝真空管采集外周靜脈血2ml，經(jīng)典酚－氯仿－異戊醇法提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣本測(cè)定兩次，取其平均值。如果兩次誤差超過(guò)10%，則進(jìn)行第3次測(cè)定，然后取兩個(gè)相近數(shù)值的平均值，最后將所有DNA樣品稀釋至終濃度20ng／μl。

（3）引物的合成：根據(jù)Primer3.0軟件設(shè)計(jì)PGC－1α基因的引物。上游引物序列：5＇－CAGTCAAGCTGTTTTTGACGAC－3＇；下游引物序列：5＇－TCACTTTCATCTTCGCTGTCAT－3＇。引物由上海生工生物工程有限公司合成，用HPLC純化。

（4）PCR：在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行普通PCR反應(yīng)。PCR體系包括20ng的基因組DNA、1×PCR Master mix（已含MgCl2）、500nmol的正反向引物，并用PCR級(jí)別的水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，55℃退火1 min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃在延伸7 min，并于4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

（5）高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）分析方法檢測(cè)PGC－1α基因Gly482Ser G＞A基因型：普通PCR反應(yīng)擴(kuò)增特異性條帶成功后，在Light Cycler 480熒光定量分析儀上采用HRM方法進(jìn)行PGC－1基因Gly482Ser G＞A多態(tài)性分析。PCR和HRM分析均在Light Cycler 480上進(jìn)行。PCR體系包括10ng的基因組DNA、1×PCR Master mix、2mmol／L MgCl2、200nmoL的正反向引物，并用PCR級(jí)別的水補(bǔ)足至20μl。PCR條件：95℃預(yù)變性10min后行觸底PCR，即95℃10 s，65℃－55℃退火15s，72℃10s，55個(gè)循環(huán)，其中前十個(gè)循環(huán)65℃－55℃，每個(gè)循環(huán)退火溫度降一度，后45個(gè)循環(huán)退火溫度維持55℃。HRM分析條件：95℃1min，40℃1min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從65℃到95℃，溫度上升率為1℃／s，且每升高l℃進(jìn)行15次數(shù)據(jù)采集。最后40℃冷卻10s。應(yīng)用gene scanning軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)檢測(cè)和分析。隨機(jī)選取不同熔解曲線的產(chǎn)物共20例測(cè)序驗(yàn)證基因型結(jié)果。以測(cè)序得到的野生純合子GG、突變雜合子GA和突變純合子AA分別作為標(biāo)準(zhǔn)品，分析其它DNA樣本基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，如果方差不齊或者不符合正態(tài)分布均進(jìn)行數(shù)值轉(zhuǎn)換，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)兩兩比較三組之間人口學(xué)和生化指標(biāo)的差異；基因型等計(jì)數(shù)資料的比較以及Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)均使用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均利用SPSS17.0軟件處理，雙側(cè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

361例IGR和430例T2DM的平均年齡分別為54.01±10.92歲和53.74±12.00歲（P＝0.852）。和2型糖尿病組比較，IGR組人群僅有BMI明顯降低（P＝0.018），而 WBC、TG、TC、HDL－C和LDL－C均無(wú)顯著性差異（表1）。

根據(jù)熔解曲線熒光和峰值的差異來(lái)有效區(qū)分不同標(biāo)本PGC－1α基因482位點(diǎn)多態(tài)性，結(jié)果由Light Cycler 480gene scanning軟件輸出，該位點(diǎn)的基因型明顯的分為GG、GA、AA三型，且與測(cè)序結(jié)果一致（圖1、圖2）。

表1 IGR組和T2DM組個(gè)體一般情況比較

圖1 Light Cycler 480高分辨率熔解曲線

PGC－1α基因482位點(diǎn)多態(tài)性的基因型經(jīng)遺傳平衡定律檢驗(yàn)符合Hardly－Weinberg平衡法則，提示研究對(duì)象具有群體代表性。由表2可見(jiàn)，AA純合子在T2DM組中的頻率0.209，在IGR組中為0.152，前者頻率高于后者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；G等位基因和A等位基因頻率在兩組間比較，IGR組人群擁有較低的A等位基因頻率，且差異具有顯著性意義（表2、圖3）。而IGR組與NGT組比較，基因型及等位基因分布頻率均無(wú)顯著性差異（表3、圖4）。

表2 T2DM組和IGR組PGC－1α基因型與等位基因分布頻率

表3 NGT組和IGR組PGC－1α基因型與等位基因分布頻率

IGR組PGC－1α基因482位點(diǎn)GG基因型和GA＋AA基因型的表型間的BMI、TC、HDL－C和LDL－C比較，P均＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。IGR包括了IFG、IGT以及兩者合并存在三種狀態(tài)，為減少影響因素，本研究在剔除了IFG和IGT合并存在的IGR人群后，分別對(duì)IFG人群和IGT人群進(jìn)行PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性與臨床變量的深入分析。研究發(fā)現(xiàn)，IGR組IFG人群PGC－1α基因482位點(diǎn)多態(tài)性GG基因型和GA＋AA基因型的臨床變量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在IGT人群中，含 A的基因型（GA＋AA）則表現(xiàn)出更高的餐后2小時(shí)血糖 （PBG）水平，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.027），而B(niǎo)MI、TC、HDLC和LDL－C水平在GA基因型和GA＋AA基因型之間均無(wú)顯著性差異（表5）。

表4 IGR組PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性與臨床變量

表5 IGR組IFG人群和IGT人群PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性與臨床變量

圖2 PGC－1α基因482位點(diǎn)測(cè)序圖

圖3 等位基因在NGT、IGR及T2DM三組間分布頻率圖

3 討論

T2DM是多基因遺傳病，至今尚未從基因角度完全闡明其發(fā)病機(jī)制。隨著疾病基因組學(xué)研究的深入，作為第3代遺傳標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）篩查及其與疾病相關(guān)性分析近年倍受關(guān)注。SNP是指在基因組水平上，因單個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失而形成的一種與疾病群體易感性和個(gè)體表型差異相關(guān)，甚至參與某些疾病發(fā)病過(guò)程的DNA序列改變。PGC－la是PGC－1家族的第一個(gè)成員。PGC－1α可輔助激活核受體PPAR－α和PPAR－γ及肌肉增強(qiáng)因子2C（muscle enhance factor 2C，MEF2C）等一系列與糖脂代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，是機(jī)體能量代謝的重要調(diào)控者。MEF2C是骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子（glucose transporter，GLUT4）的上游調(diào)控子，經(jīng) PGC－1α輔助激活后調(diào)節(jié)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取過(guò)程。PGC－1α基因中部403－570區(qū)域（稱(chēng)為“MEF2C結(jié)構(gòu)域”）可以與MEF2C多肽鏈的第93－174aa區(qū)域特異結(jié)合，482位點(diǎn)恰好位于該結(jié)構(gòu)域的中心，此位點(diǎn)的錯(cuò)義突變有可能影響PGC－1α與MEF2C的結(jié)合，進(jìn)而影響MEF2C對(duì)下游基因GLUT4表達(dá)的調(diào)控［6］。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性與T2DM相關(guān)，他們認(rèn)為PGC－1α基因可能參與了糖尿病發(fā)?。?－8］。然而，在糖尿病前期人群中卻少見(jiàn)Gly482Ser多態(tài)性的相關(guān)研究。鑒于此，本課題首次應(yīng)用HRM方法對(duì)云南省昆明地區(qū)361例糖尿病前期人群進(jìn)行PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性進(jìn)行分析。

傳統(tǒng)用于檢測(cè)SNP的方法是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR－RFLP）技術(shù)，但其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、容易交叉污染、達(dá)不到高通量的要求，而且溴化乙錠致癌性強(qiáng)。其它用于檢測(cè)SNP的方法也都有一定的局限性，如Taqman探針技術(shù)則價(jià)格昂貴，直接測(cè)序法雖然是目前檢測(cè)基因型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其步驟多而分散、工作量大、周期長(zhǎng)、成本較高，不適合臨床和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。HRM技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，可實(shí)現(xiàn)高通量的閉管操作、避免污染，且成本低、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有極強(qiáng)的可操作性，已成為遺傳學(xué)、方法學(xué)研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)，有望成為分子診斷的常規(guī)方法［9－10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HRM方法對(duì)PGC－1α基因Gly482Ser多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與直接測(cè)序一致，為今后HRM檢測(cè)方法的廣泛應(yīng)用提供參考依據(jù)。我們測(cè)定1237例受試者，結(jié)果顯示，rs8192678位點(diǎn)AA純合子在云南省昆明地區(qū)430例T2DM中的頻率為0.209，在361例糖尿病前期人群中為0.152，兩組間無(wú)顯著性差異；G等位基因和A等位基因頻率在兩組間比較，IGR組人群擁有較低的A等位基因頻率，且差異具有顯著性意義。而IGR組與NGT組比較，基因型及等位基因分布頻率均無(wú)顯著性差異。本研究觀察到PGC－1α基因482位點(diǎn)A等位基因（包括GA和AA型）更易出現(xiàn)在2型糖尿病人群，且A等位基因頻率與2型糖尿病的發(fā)生呈正相關(guān)?？梢酝茰y(cè)，PGC－1α基因482位點(diǎn)A等位基因可能是糖尿病前期人群疾病進(jìn)展的一個(gè)分子標(biāo)記。也就是說(shuō)，含有A等位基因的糖尿病前期人群更易進(jìn)展為2型糖尿病。

IGR組PGC－1α基因482位點(diǎn)GG基因型和GA＋AA基因型的表型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果提示除PGC－1α基因482位點(diǎn)A等位基因外，還可能存在其它的未知因素共同影響糖尿病前期人群血脂的代謝水平。PGC－1α基因482位點(diǎn)A等位基因，作為糖尿病前期人群疾病進(jìn)展的分子標(biāo)記之一，也許并未對(duì)糖尿病前期人群可能出現(xiàn)的血脂紊亂做出重要的貢獻(xiàn)，而僅是其發(fā)生的因素之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，在IGT人群中，含A的基因型（GA＋AA）表現(xiàn)出更高的PBG水平，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而B(niǎo)MI、TC、HDL－C和 LDL－C水平在野生型（GA）和突變型（GA＋AA）之間均無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明PGC－1α基因482位點(diǎn)A等位基因（包括GA和AA型）更易合并餐后高血糖，且A等位基因頻率與餐后血糖值呈正相關(guān)。這可能與PGC－1αA等位基因易引起胰島β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌障礙有關(guān)，其可能機(jī)制為PGC－1α可通過(guò)上調(diào)胰島β細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白2表達(dá)，使線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)，ATP／ADP比率下降，通過(guò)影響鉀離子通道，進(jìn)而抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌［11］。

隨著生活方式的改變，T2DM發(fā)病率逐年升高，其后備軍即糖尿病前期人群數(shù)量亦是與日俱增，作為一個(gè)多基因遺傳性疾病，基因在其發(fā)病中的作用至關(guān)重要。隨著對(duì)PGc－1a基因研究的深入，其在調(diào)節(jié)能量代謝和諸多基因轉(zhuǎn)錄中具有重要作用。鑒于此，我們?nèi)匀黄惹行枰獙ふ乙恍┓肿訕?biāo)記，從而對(duì)糖尿病前期人群疾病的轉(zhuǎn)歸進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期達(dá)到早期診斷和治療的目的。本課題只是在應(yīng)用HRM方法的基礎(chǔ)上對(duì)較小樣本糖尿病前期人群PGC－1α基因Gly482Ser進(jìn)行了多態(tài)性分析，并推測(cè)含有A等位基因的糖尿病前期人群更易合并餐后高血糖，更易進(jìn)展為2型糖尿病。當(dāng)然，精確的評(píng)估尚需通過(guò)大規(guī)模臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究予以證實(shí)。

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