齊 紅，劉玉俠，任林廣，徐廣偉，段北野，趙珍誼

（1.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012；2.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春130012）

腫瘤免疫學研究證實，機體功能降低是導致惡性腫瘤發(fā)生的主要因素之一，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、療效及預后有直接的影響［1］?？鼓[瘤免疫主要是細胞免疫，T淋巴細胞在腫瘤免疫中起中心調(diào)控作用［2］。

流式細胞儀結(jié)合現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)，可同時對單個細胞上的多種參數(shù)進行定量定性分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點。因而，流式細胞術(shù)進行淋巴細胞免疫表型分析已逐漸成為腫瘤臨床檢驗的常規(guī)工作之一。

關(guān)于惡性腫瘤患者免疫功能的變化已有很多報道［3－8］，本文主要探討肺癌患者外周血淋巴細胞亞群與性別、年齡及臨床分期的關(guān)系。對此尚未見相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源

患者標本：我們收集了本院自2009年以來住院的肺癌患者外周靜脈血。其中，男44例，女43例，年齡39－80歲，中位年齡59歲。均經(jīng)病理或細胞學檢查確診證實，。按TNM分期，Ⅰ期23例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期26例。

正常對照組標本：取自長春市中心血站獻血員外周靜脈血，年齡20－40歲，男性62例，女性38例。

1.2 主要儀器及試劑

流式細胞儀及相關(guān)熒光標記單克隆抗體均購自美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

采用流式細胞術(shù)，通過四色熒光標記進行淋巴細胞亞群的檢測，采用CellQuestPro軟件分析淋巴細胞群體百分含量。實驗步驟簡述如下：加入熒光抗體CD45／／483染液5μl于 A管中，CD3／16＋56染液10μl于B管中，向各管內(nèi)分別加入相對應的細胞樣品各100μl，充分混勻，20－25℃條件下避光標記15－20min。再向各管內(nèi)分別加入生理鹽水1 ml，震蕩混勻，避光保存。4h內(nèi)上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗。

2 結(jié)果

肺癌組與正常對照組比較CD3＋、CD3＋CD4＋及CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數(shù)明顯下降（P＜0.01），而 CD3＋CD8＋和 CD3＋CD16＋CD56＋細胞兩組間無顯著變化，見表1。

患者的性別不同，淋巴細胞亞群百分數(shù)也有不同。表2結(jié)果顯示，女性CD3＋CD4＋細胞明顯多于男性（P＜0.01），而CD3－CD16＋CD56＋細胞明顯少于男性（P＜0.01）。

淋巴細胞亞群百分數(shù)還與患者的年齡有關(guān)。從表3和表4可見，51－60歲年齡段患者CD3＋CD4＋細胞百分數(shù)明顯低于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD4＋細胞百分數(shù)（P＜0.01），而 CD3＋CD8＋細胞百分數(shù)明顯高于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD8＋細胞百分數(shù)（P＜0.05）≦50歲年齡段患者CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數(shù)明顯少于51－60歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數(shù)（P＜0.01）。

肺癌患者的病理分期與其免疫功能狀態(tài)更是關(guān)系密切。表5和表6數(shù)據(jù)表明，除了CD3－CD16＋CD56＋細胞以外，其他4個亞群基本上隨著分期愈晚數(shù)值愈低。Ⅰ期與Ⅱ期之間差異不明顯。

我們還對CD3＋CD8＋細胞的兩個亞群CD8＋／CD28＋和CD8＋／CD28－進行了比較，發(fā)現(xiàn)隨著分期愈晚CD8＋／CD28＋數(shù)值愈低而CD8＋／CD28－則恰恰相反（見表7和表8）。

表1 肺癌患者與正常對照組淋巴細胞亞群比較（±s）

表1 肺癌患者與正常對照組淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數(shù)值（%）患者（n＝87） 健康（n＝100） P值59.18±8.05 69.98±5.79 0.0000 CD3＋CD4＋ 31.16±5.75 35.25±5.16 0.0000 CD3＋CD8＋ 24.12±4.27 25.08±4.34 0.1856 CD3－CD16＋CD56＋ 13.02±4.21 14.91±4.87 0.0054 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋2.81±0.87 2.73±1.09 0.5836

表2 男女肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表2 男女肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數(shù)值（%）男性（n＝44） 女性（n＝43） P值57.94±8.44 60.45±8.69 0.1753 CD3＋CD4＋ 29.16±5.52 33.19±6.12 0.0013 CD3＋CD8＋ 25.03±4.37 23.20±5.07 0.0747 CD3－CD16＋CD56＋ 15.06±3.67 10.83±3.48 0.0000 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋2.48±1.41 2.10±1.09 0.1639

表3 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表3 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數(shù)值（%）≦50（n＝13）51－60（n＝35） ≥61（n＝39）58.52±6.25 59.57±7.26 58.65±6.84 CD3＋CD4＋ 33.57±5.08 29.23±4.94 31.88±7.86 CD3＋CD8＋ 21.58±1.62 25.91±5.56 23.40±3.61 CD3－CD16＋CD56＋ 11.15±2.99 13.25±4.51 13.16±4.24 CD3＋CD16＋CD56＋CD3＋3.55±0.97 1.97±1.02 1.63±0.77

表4 各年齡段肺癌患者淋巴細胞亞群比較結(jié)果

表5 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較（±s）

表5 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較（±s）

細胞表面標志淋巴細胞亞群數(shù)值（%）Ⅰ（n＝23） Ⅱ（n＝15） Ⅲ（n＝23） Ⅳ（n＝26）CD3＋ 61.79±6.38 62.22±7.35 57.85±6.80 56.02±7.32 CD3＋CD4＋ 33.77±6.36 32.55±4.41 29.59±5.77 30.61±6.22 CD3＋CD8＋ 25.14±5.36 27.44±4.35 24.53±5.58 20.99±3.67 CD3－CD16＋CD56＋ 14.58±2.67 10.83±3.05 11.96±3.76 15.56±3.74 CD3＋CD16＋CD56＋3.71±1.29 3.16±1.44 3.23±0.60 1.55±0.68

表6 肺癌不同分期患者淋巴細胞亞群比較結(jié)果

表7 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數(shù)值比較（±s）（n＝10）

表7 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數(shù)值比較（±s）（n＝10）

細胞表面標志 CD3＋CD8＋亞群數(shù)值（%）ⅠⅡⅢⅣ10.51±2.14 9.30±1.46 8.92±0.66 6.63±1.57 CD8＋／CD28－ 16.59±2.84 17.73±2.50 18.34±4.80 18.72±3.61 CD8＋／CD28＋

表8 不同分期肺癌患者CD3＋CD8＋亞群數(shù)值比較結(jié)果

3 討論

淋巴細胞亞群分析是檢測機體免疫功能的重要指標，它總體反映機體當前的免疫功能、狀態(tài)和平衡水平，并可以輔助診斷某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態(tài)反應性疾病等），對分析發(fā)病機制，觀察療效及評估預后有重要意義。

CD3代表總T細胞，存在于所有成熟T細胞膜表面，是機體最重要的免疫細胞群。在機體的抗腫瘤免疫應答反應中，以T細胞亞群的細胞免疫為主。根據(jù)T細胞表面的分化抗原可將成熟T細胞分為CD3＋CD4＋和CD3＋CD8＋兩大亞群，前者為輔助／誘導T細胞，具有調(diào)節(jié)免疫反應的活性，可以輔助B細胞產(chǎn)生抗體，繼而分泌細胞因子。后者為抑制／殺傷T細胞，具有免疫抑制和細胞毒性作用［9－10］。

有報道表明，以CD16和CD56聯(lián)合標記并通過CD3雙色標記用以區(qū)分 NK細胞（CD3－CD16＋CD56＋）和 NK樣 T細胞（CD3＋CD16＋CD56＋），方法穩(wěn)定而實用，具有重要的臨床應用價值［11］。

NK細胞是不同于T、B淋巴細胞，具有直接殺傷靶細胞效應的一類淋巴細胞。NK細胞殺傷效應的靶細胞有腫瘤細胞、病毒或細菌感染的細胞以及機體某些正常細胞，具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能，從而行使免疫監(jiān)視功能，在抑瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面起重要作用［12］。

通常認為，構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的淋巴細胞有三種細胞系組成，一是由胸腺產(chǎn)生的T細胞，二是由骨髓分化而來的產(chǎn)生抗體的B細胞，三是自然殺傷細胞（NK細胞）。而新近發(fā)現(xiàn)存在第四種淋巴細胞—NKT細胞。它是同時顯示NK細胞和T細胞某些特征的一類免疫細胞，具有細胞毒性和免疫調(diào)節(jié)作用。

在本研究中，我們檢測了CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3－CD16＋CD56＋和 CD3＋CD16＋CD56＋5種表型，檢測結(jié)果以在淋巴細胞中的百分比表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌組 CD3＋、CD3＋CD4＋和CD3－CD16＋CD56＋細胞均顯著低于正常對照組（P＜0.01），CD3＋CD8＋和CD3＋CD16＋CD56＋細胞兩組間無顯著差異。這與相關(guān)報道趨勢一致［13］。

患者的性別不同，淋巴細胞亞群百分數(shù)也有不同。女性CD3＋CD4＋細胞明顯多于男性（P＜0.01），而CD3－CD16＋CD56＋細胞明顯少于男性（P＜0.01）。

淋巴細胞亞群百分數(shù)還與患者的年齡有關(guān)。51－60歲年齡段患者CD3＋CD4＋細胞百分數(shù)明顯低于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD4＋細胞百分數(shù)（P＜0.01），而CD3＋CD8＋細胞百分數(shù)明顯高于≦50歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD8＋細胞百分數(shù)（P＜0.05）；50歲年齡段患者 CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數(shù)明顯少于51－60歲和≥61歲年齡段患者的CD3＋CD16＋CD56＋細胞百分數(shù)（P＜0.01）。

在正常人群中，有人報道了淋巴細胞亞群存在性別差異和年齡差異，甚至存在地區(qū)和民族差異［14］。焦陽等研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)人群不同年齡組淋巴細胞亞群存在較大差異。青年組（19－44歲）、中年組（45－64歲）、老年組（＞65歲）三組相比B細胞絕對值、T細胞絕對值、CD8＋T細胞絕對值有顯著差異［15］。

郭志宏等研究發(fā)現(xiàn)男性和女性的CD3＋百分率和CD3＋CD4＋細胞百分率和絕對數(shù)均有差異，表現(xiàn)為女性高于男性。而CD3＋絕對數(shù)和CD3＋CD8＋細胞百分數(shù)和絕對數(shù)沒有性別差異［16］。關(guān)于惡性腫瘤患者淋巴細胞亞群是否存在性別差異和年齡差異，未見相關(guān)報道。

肺癌患者的病理分期與其免疫功能狀態(tài)更是關(guān)系密切。我們的結(jié)果表明，除了 CD3－CD16＋CD56＋細胞以外，其他4個亞群基本上隨著分期愈晚數(shù)值愈低。Ⅰ期與Ⅱ期之間差異不明顯。這與相關(guān)報道也是一致的。

CD3＋CD8＋細胞由CD28可以區(qū)分出T抑制細胞亞群CD8＋／CD28－和細胞毒T細胞（CTL）亞群CD8＋／CD28＋［17］，二者分別是淋巴細胞中重要的免疫調(diào)節(jié)細胞和殺傷效應細胞。

本實驗中，我們對CD3＋CD8＋細胞的兩個亞群CD8＋／CD28＋和 CD8＋／CD28－進行了比較，發(fā)現(xiàn)隨著分期愈晚CD8＋／CD28＋數(shù)值愈低而CD8＋／CD28－則恰恰相反。

綜上所述，我們對肺癌患者與正常對照組人群的淋巴細胞亞群進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)肺癌患者淋巴細胞亞群多項指標發(fā)生明顯變化，表明其免疫功能低下。而且隨著臨床分期愈晚降低愈明顯。同時，我們還對肺癌患者淋巴細胞亞群變化與其性別年齡進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)有些變化與其性別年齡有關(guān)。我們認為檢測肺癌患者外周血淋巴細胞亞群對了解患者免疫功能，病情進展和預后評估都將具有重要的臨床意義，也將為免疫治療提供理論依據(jù)。

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