侯 波

（吉林省人民醫(yī)院 急診外科，吉林 長春130021）

血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）作為腎素－血管緊張素系統(tǒng)中的第一步限速反應(yīng)的底物，不僅在調(diào)節(jié)血壓和穩(wěn)定體液平衡方面發(fā)揮著極為重要的作用，而且能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移和腫瘤血管的形成［1］。位于AGT基因第2外顯子的T→C錯義突變導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第235號氨基酸的轉(zhuǎn)變：甲硫氨酸（Met）→蘇氨酸（Thr）。以往多項研究調(diào)查了AGT基因M235T多態(tài)性與多種腫瘤易感性的關(guān)系［2－6］。然而，其與中國人群結(jié)直腸癌的相關(guān)性尚未見報道。本研究采用病例－對照研究分析了AGT基因M235T多態(tài)性與中國人群結(jié)直腸癌的相關(guān)性，旨在尋求新的結(jié)直腸癌分子遺傳學(xué)標(biāo)記物，為揭示其發(fā)病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選自入住我院普外科結(jié)直腸癌患者151例，男性90例，女性61例，平均年齡59.7（±13.4）歲。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)確診，其中高中分化87例，低分化64例；臨床Ⅰ－Ⅱ期86例，臨床Ⅲ－Ⅳ期65例；有遠處轉(zhuǎn)移87例，無轉(zhuǎn)移64例。對照組選自我院健康體檢中心，共202例，男性128例，女性74例，平均年齡57.3（±11.5）歲，無腫瘤家族史，各項體檢指標(biāo)均正常。所有入選對象均為無血緣關(guān)系漢族個體。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成 采集入選對象者外周靜脈血3ml，按照北京百泰克生物科技公司全血基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA。參照文獻［7］設(shè)計引物，上游引物：5’－CAGGGTGC TGTCCACACTGGACCCC－3’，下游引物：5’－CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT－3’。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增 PCR 反應(yīng)體系為25μl，含10×反應(yīng)緩沖液3.0μl，dNTP 2.5μl，MgCl21.5μl，上、下游引物各0.25μl，TaqDNA 聚合酶1.0U，基因組DNA 1.5μl，用無菌去離子水補足至25μl。

在PCR擴增儀（Eppendorf 5331，德國）上按以下條件進行循環(huán)反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，67℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；末次循環(huán)后72℃延伸10min。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴增產(chǎn)物 取PCR擴增產(chǎn)物3μl，用限制性內(nèi)切酶TthIII I（NEB公司，美國）酶切。65℃孵育4小時，反應(yīng)終止后，酶切產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，以DNA MarkerI作為標(biāo)準(zhǔn)參照物分析判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

直接計數(shù)法計算結(jié)直腸癌組和對照組AGT M235T基因型和等位基因頻率，Hardy－Weinberg遺傳平衡定律用于檢測基因型的遺傳平衡狀態(tài)，各組間比較采用χ2檢驗，比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI）用于估計相對危險度。所有數(shù)據(jù)均運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包處理，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

PCR擴增片段大小為165bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶TthIII I酶切后呈現(xiàn)以下三種情況：MM基因型（165bp一條帶）；MT基因型（165bp、141bp和24 bp三條帶）；TT基因型（141bp和24bp兩條帶）。

結(jié)直腸癌組與對照組AGT M235T基因型和等位基因頻率分布見表1，兩組基因型頻率均符合Hardy－Weinberg平衡（P＞0.05），表明入選對象具有較好的群體代表性。結(jié)直腸癌組AGT M235T基因型（TT、MT和MM）和等位基因（T和M）構(gòu)成比與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

根據(jù)臨床病理特征進行分層分析，發(fā)現(xiàn)TT基因型在高中分化和低分化結(jié)直腸癌患者中分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6.95，P＝0.008），比值比（95%CI）為2.50（1.26－4.97）；未發(fā)現(xiàn) AGT M235T多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間存在明顯相關(guān)性（P＞0.05）（見表2）。

表1 結(jié)直腸癌組與對照組AGT M235T多態(tài)性分布

表2 AGT M235T多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，盡管其發(fā)病機制尚未完全闡明，但已經(jīng)證實其發(fā)生發(fā)展是多因素長期共同作用的結(jié)果，其中肥胖被認為是結(jié)直腸癌的一個重要危險因素［8］。血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）主要在肝臟合成，肝外主要來源于脂肪組織；脂肪組織中過表達AGT mRNA能夠造成血漿AGT含量明顯增高，同時造成脂肪堆積，最終引起肥胖［9］。在小鼠動物模型中，AGT基因缺陷能夠部分阻止由于飲食引起的肥胖［10］。由此推測，肥胖相關(guān)基因（AGT）與結(jié)直腸癌的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。

本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性方法探討了中國人群AGT基因M235T多態(tài)性與結(jié)直腸癌易感性的關(guān)系，雖然未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性在病例組和對照組中存在明顯相關(guān)性，但是分層分析發(fā)現(xiàn)低分化結(jié)直腸癌患者中TT基因型頻率明顯高于高中分化結(jié)直腸癌患者，攜帶TT基因型個體患低分化結(jié)直腸癌的風(fēng)險比攜帶MT／MM基因型高2.50倍，表明攜帶TT基因型的結(jié)直腸癌患者更容易呈現(xiàn)低分化狀態(tài)和更高的惡性程度。

該研究結(jié)果與文獻報道一致，Vasku等調(diào)查了捷克人群中AGT M235T多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系（102例結(jié)直腸患者和101例非結(jié)直腸癌個體），發(fā)現(xiàn)AGT M235T多態(tài)性在病例組和對照組中分布無差異，并且與臨床分期無關(guān)［6］。遺憾的是，該研究未進一步分析該多態(tài)性與結(jié)直腸癌分化狀態(tài)的相關(guān)性。關(guān)于AGT M235T多態(tài)性與其他腫瘤易感性的關(guān)系，目前，文獻報道結(jié)果并不一致。Gonzalez－Zuloeta等報道AGT M235T多態(tài)性 M等位基因增加了荷蘭絕經(jīng)后婦女乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險［5］。然而，Mendizabal－Ruiz等報道AGT M235T多態(tài)性與墨西哥婦女乳腺癌的發(fā)病無關(guān)［4］。此外，有報道AGT M235T多態(tài)性與口腔癌、胃癌的發(fā)病無關(guān)［2，3］。不能排除這種差異是由于種族差異引起的，因此，有必要進行多中心、多種族、大樣本的協(xié)同研究以明確AGT M235T多態(tài)性與腫瘤的相關(guān)性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AGT M235T多態(tài)性與中國人群結(jié)直腸癌的分化程度密切相關(guān)，攜帶TT基因型的結(jié)直腸癌患者更容易呈現(xiàn)低分化病理狀態(tài)。更大樣本量的重復(fù)驗證性研究有望為結(jié)直腸癌的風(fēng)險預(yù)測、個體化用藥和臨床有效防治提供新的線索。

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