趙曉苗，趙一凡，趙宇正，趙煒疆，唐雪蓮，謝梅青＊

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院a.婦產(chǎn)科；b.麻醉科，廣東 廣州510120；2.肇慶市第一人民醫(yī)院；3.汕頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心；4.深圳市婦兒醫(yī)院）

多聚酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性 （Polymerase－chain reaction－restriction fragment length Polymorphism，PCR－RFLP）是傳統(tǒng)的檢驗基因多態(tài)性的方法，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型［］。變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）是一種基于 WAVE系統(tǒng)分析的新高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)，原理是用離子對反向高效液相色譜法分離并檢測異源雙鏈，目前已用于基因序列的比較、人類基因多態(tài)性及疾病相關(guān)性的研究［2］。本研究采用RFLP和DHPLC分析兒茶酚O－甲基轉(zhuǎn)移酶 （catachol－O－methyltransferase，COMT）基因的第4號外顯子第158位密碼子G／A的多態(tài)性，并結(jié)合DNA測序法比較兩種方法的可行度、可信度和優(yōu)缺點。

1 材料和方法

1.1 研究對象 病例組選擇1999年11月－2004年11月收治我科經(jīng)病理確診的50例子宮內(nèi)膜癌患者，其中18例收集蠟塊包埋組織，32例抽取全血；對照組選擇同期收治經(jīng)病理確診子宮脫垂并排除其他婦科疾病的患者，其中31例蠟塊包埋組織，19例抽取全血。兩組病人均大于40歲，為我國漢族人，被抽取血標本的患者全部知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA 的制備：① 采用無菌ddH《》2O 和PBS液提取白細胞后，用DNA提取液（達安基因公司提供）提取全血基因組DNA。②蠟塊包埋組織的DNA提取：切取8μm蠟塊切片8張，二甲苯脫蠟，TE9提取液消化，等體積酚－氯仿溶液抽提3次，無水乙醇沉淀DNA。TE9提取液制備：500mmol／L Tris，20mmol／L EDTA，10mmol／L NaCL，1%SDS，500μg／ml蛋白酶 K，PH8.0。

1.2.2 PCR擴增：參照文獻［3］設(shè)計引物，為使兩條引物的Tm值更接近，在前引物5’端置換1個堿基。序列為5’－TGCTGTGGCTACTCAGCTGTG－3’，5’－TGAACGTGGTGTGAACACCTG－3’。 反應(yīng)體系為：10＊PCR buffer 5μL，d NTP Mixture（各2.5mM）4μL，一對引物（各50mM）各0.5－1 μL，模板 DNA（0.1－0.5μg）5μL，Taq酶0.5u，dd H2O加至50μL。反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30 s，67℃（蠟塊包埋組織DNA）或64℃（全血DNA）30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃延伸7min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 酶切反應(yīng) 取PCR產(chǎn)物10μL，NiaⅢ 酶（5U）0.5μL，37℃孵育3h行酶切反應(yīng)。采用20%非變性聚丙烯酰胺凝膠行酶切產(chǎn)物電泳，據(jù)酶切圖譜判斷基因型。

1.2.4 變性高效液相色譜分析：WAVE系統(tǒng)分析的基本流程：部分變性溫度在接近DNA解鏈溫度（Tm）附近進行檢測，將DNA序列及選擇檢驗的方式輸入計算機，軟件系統(tǒng)自動模擬選擇最佳分離梯度，每次上樣5μL。上樣PCR產(chǎn)物被流動相以0.9 mL.min－1的速度帶至DNA分離柱進行目的DNA片段分離，分析一個樣品需要8min左右。第一次上樣：WAVE峰圖有兩種峰型，單峰代表被分離的DNA片段為純合基因型，雙峰代表雜合基因型。第二次上樣：以測序證實的COMT野生型純合子（COMTVal／Val）為對照，把 COMTVal／ValPCR產(chǎn)物與等量的單峰樣品混合行DHPLC分析。如仍為單峰，說明被檢測樣品是COMTVal／Val，如為雙峰，說明被檢測樣品為 COMTMet／Met。

1.2.5 DNA變異的序列測序鑒定：隨機抽取20例PCR產(chǎn)物交上海博亞廣州分公司測序（AB 3700自動激光熒光測序儀）。

1.2.6 統(tǒng)計方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗比較兩組的COMT基因型頻率分布，Kappa統(tǒng)計量分析PCR－RFLP以及DHPLC法和測序方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 擴增的PCR產(chǎn)物為237bp。本組所有血標本均可一次擴增成功。個別蠟塊標本需要在跑完第一次PCR后，把目的條帶切割回收，再跑一次PCR，以提高產(chǎn)物純度，最終可順利行酶切反應(yīng)。

2.2 RFLP分析結(jié)果 所有PCR產(chǎn)物均可進行酶切反應(yīng)，NiaⅢ酶辨認CATG回文序列切割，得到片段見表1。

表1 酶切片段結(jié)果

酶切圖見圖1。與DNA測序（見圖2）驗證的結(jié)果比較（表1），Kappa值＝0.697，P＝0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義，認為RFLP法與測序法的一致性好。

2.3 DHPLC結(jié)果 全部血標本擴增的PCR產(chǎn)物可行DHPLC分析，但只有小部分蠟塊包埋組織的PCR產(chǎn)物可行DHPLC分析。第一次上樣分離的單峰為 COMTVal／Val或 COMTMet／Met（圖3），雙峰為COMTVal／Met（圖4）。第二次上樣的雙峰為 COMTMet／Met（圖5）。DHPLC法與測序法驗證的結(jié)果比較（表2），Kappa值＝0.924，P＝0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認為DHPLC法與測序法的一致性極好。

圖1 COMT基因擴增產(chǎn)物經(jīng)Nla酶切后的電泳圖

圖2 COMTVal／Met基因測序圖

圖3 第一次上樣的COMTVal／Val和COMTMet／Met WAVE峰圖

2.4 子宮內(nèi)膜癌組與對照組COMT基因型的頻率比較 采用RFLP法檢測結(jié)果比較子宮內(nèi)膜癌組和對照組的COMT基因多態(tài)性分布（見表3）［4］。對照組以 COMTVal／Val基因型為主（48.0%），COMTVal／Met（44.0%）和 COMTMet／Met（8.0%）次之；子宮內(nèi)膜癌組則以COMTVal／Met基因型（58.0%）為主，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 第一次上樣時的COMTVal／Met和對照物的WAVE峰圖

圖5 兩種純合子加入對照物（COMTVal／Val）混合后的WAVE峰圖

表2 PCR－RFLP以及DHPLC法和測序法的一致性分析

表3 子宮內(nèi)膜癌組與對照組的COMT基因型的頻率分布比較

3 討論

以往普遍應(yīng)用RFLP分析COMT基因多態(tài)性，RFLP是根據(jù)不同品種（個體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點發(fā)生堿基突變或酶切位點之間插入或缺失堿基導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生變化，顯示為不同的酶切圖譜，從而判讀基因型，廣泛應(yīng)用于單核甘酸多態(tài)性檢測，基因組遺傳圖譜構(gòu)建，基因定位以及生物進化和分類的研究［5］。本研究原計劃收集全血提取DNA進行COMT基因多態(tài)性的分析，后來由于時間受限、樣本數(shù)目受限制，增加了病理科庫存的蠟塊包埋組織，從中提取的DNA基本可以滿足PCRRFLP的應(yīng)用需要。

然而RFLP法存在非特異性切割現(xiàn)象和對多個切割位點有個別切不開的問題，且小片段DNA可能在聚丙烯酰胺電泳過程中降解，操作較繁瑣；據(jù)酶切片段的多少和大小，敏感性不一，檢出率約16.3%－100%［6］。本組全血標本和蠟塊包埋組織雖然可以全部提取出DNA，但由于COMT基因目的PCR片段為236bp，酶切為4－6個片段，每個片段都較小，故存在一定的誤差。與測序法比較，Kappa值＝0.697，認為兩法的一致性好，RFLP法基本可以用于COMT基因多態(tài)性的分析，均適用于全血和蠟塊包埋組織。

DHPLC能以三種方式操作：（1）在不變性溫度下，色譜儀類似凝膠電泳儀，分離分子量不同的雙鏈DNA分子。（2）在充分變性溫度下，區(qū)分單鏈DNA或RNA分子。（3）在部分變性的溫度下，識別變異型和野生型的PCR產(chǎn)物：雜合子和純合子PCR產(chǎn)物在部分變性的溫度下，分別形成同源雙鏈和錯配形成異源雙鏈，異源雙鏈由于堿基對不匹配，會在不匹配的堿基對處部分解鏈，比同源雙鏈先洗脫出來［7］，根據(jù)柱上的保留時間不同可以分辨異源雙鏈與同源雙鏈識別雜合子型。本研究是在部分變性溫度下檢測基因突變，該種方式主要應(yīng)用于基因突變檢測、單核苷酸多態(tài)性分析（SNPs）和短片段串聯(lián)重復(fù)序列分析（STRs）等方面。

其他學(xué)者認為，DHPLC法分析單核甘酸多態(tài)性，具有自動化，快速（一個樣品約需8.8分鐘），操作簡便，檢出率高達95%－100%［6］，檢出 DNA 片段大小范圍廣等優(yōu)點。本組研究對于血標本擴增的PCR產(chǎn)物，DHPLC法檢出率為100%，通過與測序法比較，Kappa值＝0.924，認為兩法的一致性極好。RFLP和DHPLC相比，都需要經(jīng)過提取DNA、擴增PCR步驟，RFLP需要酶切反應(yīng)、跑膠，根據(jù)酶切圖譜判斷基因型；DHPLC直接檢測PCR產(chǎn)物，判斷基因型。但DNA分析儀對PCR產(chǎn)物的純度和質(zhì)量有一定要求，故許多蠟塊包埋組織提取的DNA擴增的PCR產(chǎn)物都不能檢測成功。

綜上所述，DHPLC法更適用于如血標本等DNA質(zhì)量較好樣本的基因多態(tài)性分析，且準確率更高、更簡便，但是在基因多態(tài)性和臨床相關(guān)性疾病研究中，短時間內(nèi)不能收集較多血樣本的情況下，需要采用蠟塊包埋組織標本進行分析，傳統(tǒng)RFLP法則不失為一個合適的方法。

［1］Ashikawa I，Kurata N，Saji S，et al.Application of restriction fragment fingerprinting with a rice microsatellite sequence to assembling rice YAC clones［J］.Genome，1999，42（2）：330.

［2］Lin SY，Chien SC，Su YN，et al.Rapid genetic analysis of oculocutaneous albinism（OCA1）using denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）system［J］.Prenat Diagn，2006.26（5）：466.

［3］Lavigne JA，Helzlsouer KJ，Huang HY，et al.An association between the allele coding for a low activity variant of catechol－O－methyltransferase and the risk for breast cancer［J］.Cancer Res，1997，57（24）：5493.

［4］趙曉苗，謝梅青，楊冬梓，等.兒茶酚－O－甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌遺傳易感性的關(guān)系［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2007，42（02）：116.

［5］Katayama H，Uematsu C.Comparative analysis of chloroplast DNA in Pyrus species：physical map and gene localization［J］.Theor Appl Genet，2003，106（2）：303.

［6］Abbas A，Lepelley M，Lechevrel M，et al.Assessment of DHPLC usefulness in the genotyping of GSTP1exon 5SNP：comparison to the PCRRFLP method［J］.Biochem Biophys Methods，2004，59（2）：121.

［7］Kakela JK，F(xiàn)riedman KD，Haberichter SL，et al.Genetic mutations in von Willebrand disease identified by DHPLC and DNA sequence analysis［J］.Mol Genet Metab，2006，87（3）：262.