安 喆，楊春艷，楊紅亮，葛麗麗，高天紅，張文琪

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033）

心肌梗死后心室重塑是一種進(jìn)行性發(fā)展的病理生理過程，是心臟對(duì)射血分?jǐn)?shù)降低所致的血流動(dòng)力學(xué)改變的一種代償反應(yīng)，主要是非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生肥大及基質(zhì)膠原網(wǎng)絡(luò)的代謝異常，它貫穿于MI后的心室肥大和心力衰竭的發(fā)展過程中［1－2］。 轉(zhuǎn)化生長因子－β1 （transforming growth factor－β1，TGF－β1）是一種局部產(chǎn)生的與各種組織器官纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子，其通過旁分泌或自分泌的方式可以刺激成纖維細(xì)胞的增生、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積而參與心室重塑。

有證據(jù)顯示，在心力衰竭的過程中（包括代償期和失代償期）心源性腎上腺素系統(tǒng)參與了心功能的代償和最終導(dǎo)致的損傷過程。人類心肌細(xì)胞主要有三種腎上腺素能受體：β1、β2和α1受體，各自具有不同的生理和病理功能。大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，卡維地洛可以以時(shí)間依賴性方式逆轉(zhuǎn)原發(fā)性或繼發(fā)性心肌重塑［2－6］?？梢越档托牧λソ呋颊叩牟∷缆?、再住院率和改善生活質(zhì)量，但其作用的細(xì)胞及分子機(jī)制尚未完全闡明。

本研究擬通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠急性心肌梗死后心衰模型，從分子水平探討TGF－β1和Ⅰ型膠原在心肌梗死后心室重塑中的作用及二者關(guān)系，探討卡維地洛對(duì)AMI后大鼠心肌重構(gòu)中心肌纖維化的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及處理

雌性Wistar大鼠40只，體重200－220g，合格證號(hào)：SCXK2（吉）200320001，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為手術(shù)組（30只）及假手術(shù)組（10只），乙醚吸入麻醉后，手術(shù)組參照文獻(xiàn)［3］方法結(jié)扎大鼠左冠脈，假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎冠脈。冠脈結(jié)扎術(shù)后72小時(shí)死亡5只大鼠，1周內(nèi)死亡1只大鼠。手術(shù)組從術(shù)后第2周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無大鼠死亡。假手術(shù)組2只大鼠死于麻醉意外。

1.2 藥物及試劑

卡維地洛由北京巨能制藥有限責(zé)任公司提供，批號(hào)：991001。RT－PCR （reverse transcription－polymerase chain reaction）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

分組及給藥 6周后，將存活的32只 Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、模型＋小劑量卡維地洛組、模型＋大劑量卡維地洛組，每組8只。模型＋小劑量卡維地洛組給予卡維地洛1mg／kg／d灌胃，模型＋大劑量卡維地洛組給予卡維地洛10mg／kg／d灌胃，假手術(shù)組及模型組灌胃給予0.5%CMC。各組分別于術(shù)后第7周開始給藥，連續(xù)給藥5周，每日1次，灌胃容積均為10ml／kg。

1.3 梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的檢測

用Trizol試劑處理梗死區(qū)心肌組織提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將3μg總RNA合成雙鏈DNA（complementary DNA，CDNA）。膠原－I（collagen－I），β－actin通過 GenBank獲得（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），并設(shè)計(jì)引物。膠原－I的上游引物5’－AGG GTC ATC GTG GCT TCT C－3’，下游引物5’－ACC TTC GCT TCC ATA CTC G－3’。βactin上游引物5’—GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC－3’，下游引物5’－CAA ACA TGA TCT GGG TCATCT TCT C－3’。取3μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別應(yīng)用上述蛋白的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性40秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸10分鐘。取10μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經(jīng)Image J軟件分析，結(jié)果以檢測蛋白／β－actin的積分光密度比值表示。

1.4 梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的檢測

用Trizol試劑處理非梗死區(qū)心肌組織提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將3μg總RNA合成雙鏈DNA（complementary DNA，CDNA）。TGF－β1、βactin基因序列通過 GenBank獲得（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），并設(shè)計(jì)引物。TGF－β1的上游引物5’－CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C－3’，下游引物5’－CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C －3’。β－actin 上游引物5’—GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC－3’，下游引物5’－CAA ACA TGA TCT GGG TCATCT TCT C－3’。取3μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別應(yīng)用上述蛋白的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5分鐘，95℃變性40秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)30次，最后72℃延伸10分鐘。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖電泳，光密度掃描后圖片經(jīng)Image J軟件分析，結(jié)果以檢測蛋白／β－actin的積分光密度比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的相關(guān)性比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 梗死區(qū)心肌組織的膠原－I mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，急性心肌梗死大鼠的梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的表達(dá)上調(diào)（P＜0.001）。與心梗對(duì)照組比較，小劑量卡維地洛組表達(dá)下調(diào)（P＜0.001），大劑量卡維地洛組表達(dá)亦下調(diào)（P＜0.001）。但小劑量卡維地洛組組與大劑量卡維地洛組組表達(dá)水平接近，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 各組梗死區(qū)心肌組織collagen I mRNA的表達(dá)

2.2 非梗死區(qū)心肌組織的膠原－I mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，急性心肌梗死大鼠的非梗死區(qū)心肌組織中膠原－I mRNA的表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。與心梗對(duì)照組比較，小劑量卡維地洛組表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），大劑量卡維地洛組組表達(dá)亦下調(diào)（P＜0.05）。其中，小劑量卡維地洛組與大劑量卡維地洛組表達(dá)水平接近，兩組間差異無顯著性（P＞0.05）（見圖2）。

2.3 心臟梗死區(qū)心肌的TGF－β1mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，心梗大鼠的梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的表達(dá)上調(diào)（P＜0.001）。與心梗對(duì)照組比較，小劑量卡維地洛組TGF－β1mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），大劑量卡維地洛組 TGF－β1 mRNA的水平與小劑量卡維地洛組接近，兩組差異沒有顯著性（P＞0.05）（見圖3）。

3 討論

圖2 各組非梗死區(qū)心肌組織collagen I mRNA的表達(dá)

圖3 各組梗死區(qū)心肌組織TGF－β1mRNA的表達(dá)

心肌梗死后心室重塑是一種進(jìn)行性發(fā)展的病理生理過程，是心臟對(duì)射血分?jǐn)?shù)降低所致的血流動(dòng)力學(xué)改變的一種代償反應(yīng)。由于梗死區(qū)的心肌變薄、拉長，心肌細(xì)胞的喪失和心臟間質(zhì)膠原的沉積及瘢痕的形成、替代；非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞肥大和成纖維細(xì)胞增生及間質(zhì)膠原的增生、纖維化，導(dǎo)致心室壁增厚、擴(kuò)張、變形，收縮和舒張功能減退，最終發(fā)展為心力衰竭。TGF－β1導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥厚，纖維細(xì)胞增生和間質(zhì)纖維化等特征性的改變。同時(shí)，TGF－β1激活一種特殊的心肌成纖維細(xì)胞－肌樣成纖維細(xì)胞，這些肌樣成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白，具有平滑肌細(xì)胞的特性，并能夠合成細(xì)胞間基質(zhì)，參與基質(zhì)的重構(gòu)。因此，積極有效的防治心室重構(gòu)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

心肌間質(zhì)主要成分是心肌膠原［5］，膠原是ECM的最豐富成分，主要是Ⅰ型膠原（占80%－85%）和Ⅲ型膠原（占10%以上），心肌膠原與心肌細(xì)胞共同維持心臟結(jié)構(gòu)和功能，心肌膠原Ⅰ、Ⅲ型的變化可以反映心肌組織的重塑。心肌梗死后膠原的過度積累則導(dǎo)致心肌僵硬度增加，順應(yīng)性降低，AMI后的心室重構(gòu)從細(xì)胞水平上包括心肌細(xì)胞重構(gòu)和心肌間質(zhì)重構(gòu)。心肌間質(zhì)主要成分是心肌膠原，為Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原占80%－85%。心肌梗死后非梗死區(qū)間質(zhì)膠原過度沉積，增加心肌的僵硬度，加重心臟重塑進(jìn)展，是損害心臟收縮和舒張功能并導(dǎo)致慢性心力衰竭主要因素。目前，關(guān)于β受體阻滯劑對(duì)梗死后心肌Ⅰ膠原影響的研究報(bào)道較少。本研究表明，大鼠心肌梗死心衰模型建立后，梗死區(qū)及非梗死區(qū)膠原沉積均不同程度增加?？ňS地洛都可減少非梗死區(qū)，尤其是右心室的總膠原及Ⅰ型膠原的含量，進(jìn)而減少心肌的僵硬度，抑制梗死后心肌重構(gòu)，進(jìn)一步地改善心功能尤其是舒張功能，其主要機(jī)制為抑制心源性腎上腺素系統(tǒng)參與的心功能的代償和最終導(dǎo)致的損傷過程。

TGF－β有5種亞型β1－β5，哺乳動(dòng)物為β1，β2，β3種亞型，TGF－β1在體細(xì)胞中所占比例最高、活性最強(qiáng)其對(duì)膠原的合成和降解均具有調(diào)節(jié)作用，可刺激心臟成纖維細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達(dá)，也可調(diào)節(jié)其膠原酶活性，減少膠原降解［7－9］。本研究表明，與假手術(shù)組比較，心梗大鼠的梗死區(qū)心肌組織中TGF－β1mRNA的表達(dá)上調(diào)。與心梗對(duì)照組比較，應(yīng)用卡維地洛的兩組TGF－β1mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），大劑量卡維地洛組 TGF－β1mRNA 的水平與小劑量卡維地洛組接近，且兩組差異沒有顯著性（P﹥0.05）。綜合上述結(jié)果，考慮卡維地洛能改善心肌梗死后大鼠細(xì)胞外基質(zhì)重塑的過程，其機(jī)制可能為通過抑制TGF－β1的表達(dá)而抑制梗死區(qū)膠原分子的合成，同時(shí)減少非梗死區(qū)膠原分子的合成，從而有效地延緩整個(gè)心肌纖維化的進(jìn)程，進(jìn)而到達(dá)逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，但這種作用沒有表現(xiàn)出依賴關(guān)系。

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