潘 敏，王 海，張 鐸，李 妍＊

（1.武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130052；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)與病原學(xué)教研室，吉林 吉林132013）

絲裂源活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）家族參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等重要過(guò)程。MAPK家族成員p42／44MAPK（Erk1／2）在生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量刺激下活化，促進(jìn)細(xì)胞增殖或抵抗凋亡；Erk1／2分子中Thr202和Tyr204位氨基酸殘基的磷酸化是其活化的標(biāo)志［1］。經(jīng)典的檢測(cè)蛋白激酶表達(dá)與磷酸化的方法是蛋白印跡（western blotting，WB）技術(shù)，但 WB步驟繁瑣，所需時(shí)間長(zhǎng)，技術(shù)難掌握。流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子方法的建立，啟發(fā)了人們探索應(yīng)用FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶。有學(xué)者應(yīng)用直接熒光染色來(lái)分析細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶，但以間接熒光染色檢測(cè)蛋白激酶的則未見(jiàn)報(bào)道［2］。本研究?jī)?yōu)化了細(xì)胞固定、打孔和洗滌等條件，采用非標(biāo)記的一抗和熒光素標(biāo)記二抗聯(lián)合標(biāo)記，即間接熒光染色－流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)磷酸化Erk1／2，所建立的檢測(cè)方法可獲得強(qiáng)而特異的信號(hào)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞A549引自美國(guó)典型物種保藏中心，Erk1／2的抑制劑PD98059購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。1640培養(yǎng)液購(gòu)自GBICO公司（美國(guó)），小牛血清購(gòu)自浙江黃巖四季青生物技術(shù)公司。β－actin、Erk1／2、磷酸化 Erk1／2（p－Erk1／2）（磷酸化位點(diǎn)為Thr202和Tyr204），購(gòu)自Cell signaling公司（美國(guó)），3種抗體均為兔多抗。FITC標(biāo)記二抗和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自中杉公司（北京）。PVDF膜、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所（上海）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃和飽和濕度條件下培養(yǎng)A549細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，以含3%小牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞6小時(shí)后分組為：繼續(xù)以3%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)；添加血清至10%繼續(xù)培養(yǎng)；加血清至10%但同時(shí)加不同濃度PD98059（10、20和40μmol）。培養(yǎng)12小時(shí)后，消化收集細(xì)胞并完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 蛋白印跡技術(shù)

每組取1×107個(gè)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜后室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2小時(shí)，將膜分別與一抗β－actin（1∶2 000）、Erk1／2（1∶1 000）、p－Erk1／2（1∶1 000）在4℃下反應(yīng)過(guò)夜。次日，用含0.5%Tween 20的TBS洗3次，再加入二抗（HRP標(biāo)記）并孵育2小時(shí)，室溫下用0.5%Tween 20／TBS洗膜3次后ECL發(fā)光。

1.4 間接標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析

如下方法進(jìn)行p－Erk1／2（1∶100）的間接免疫熒光染色，以10μg／ml的兔IgG為同型對(duì)照（isotype control）。①PBS洗滌細(xì)胞2次，采用4%的多聚甲醛固定30分鐘；②PBS洗滌后用含1% 的Triton X－100和0.5%小牛血清的PBS處理細(xì)胞30分鐘（打孔和封閉）；③含0.5%Triton X－100、0.05%Tween 20的PBS稀釋一抗或兔IgG，與細(xì)胞在室溫下反應(yīng)30分鐘；④含0.5%Triton X－100、0.05% 的Tween 20的PBS洗滌細(xì)胞2次；⑤2%的多聚甲醛固定10分鐘后洗滌細(xì)胞1次；⑥用含0.5%Triton X－100、0.05% 的Tween 20的PBS稀釋二抗（FITC－標(biāo)記鼠抗兔抗體），在室溫下反應(yīng)30分鐘；⑦含0.5%Triton X－100、0.05%Tween 20的PBS洗滌細(xì)胞2次，500μl的2%多聚甲醛固定細(xì)胞，F(xiàn)CM分析FITC熒光。

2 結(jié)果

2.1 蛋白印跡檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)Erk1／2表達(dá)及磷酸化

WB分析發(fā)現(xiàn)，低血清饑餓細(xì)胞在10%血清刺激后Erk1／2表達(dá)增加、磷酸化增強(qiáng)；PD98059以濃度依賴的方式抑制Erk1／2磷酸化，但對(duì)其表達(dá)無(wú)影響（圖1）。其中泳道“1”為低血清饑餓組，“2”為10%血清刺激組，而“3－5”分別為血清刺激后添加不同濃度PD98059組（10、20和40μmol）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞A549細(xì)胞Erk1／2磷酸化

以兔IgG染色為同型對(duì)照來(lái)設(shè)置檢測(cè)條件和陰性“門”位置（圖2A），與低血清饑餓組比較（圖2B），10%血清刺激組熒光強(qiáng)度增加（圖2C）；隨Erk1／2抑制劑濃度增加（（10、20和40μmol）），細(xì)胞的熒光強(qiáng)度下降（圖2D－F）。

圖2 FCM分析A549細(xì)胞內(nèi)Erk1／2磷酸化

3 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤和藥學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需要分析通路中各信號(hào)分子的變化，其中許多信號(hào)分子是蛋白激酶。例如，Erk1／2、p38MAPK 和JNK 等屬 于 MAPKs家族。蛋白激酶分子通常含多個(gè)可被磷酸化的氨基酸殘基，即磷酸化位點(diǎn)；不同位點(diǎn)的磷酸化與蛋白激酶的活化、結(jié)合底物或泛素化降解密切相關(guān)［3］。例如，Erk1／2分子Thr202和Tyr204磷酸化后，其活性增加。WB是檢測(cè)蛋白激酶總量和磷酸化的基本方法，但存在步驟多、技術(shù)難掌握和需要樣品量多等缺點(diǎn)［4］。目前，應(yīng)用直接熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析蛋白激酶磷酸化的方法已經(jīng)建立，具有操作簡(jiǎn)單及可準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)。由于蛋白激酶多為細(xì)胞內(nèi)蛋白，商品化試劑中熒光素標(biāo)記的一抗較少，若建立間接熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磷酸化蛋白激酶，則可實(shí)現(xiàn)對(duì)更多蛋白激酶的快速、準(zhǔn)確分析。本研究?jī)?yōu)化了關(guān)鍵條件，包括細(xì)胞膜打孔、封閉、洗滌和“抗體－激酶”的固定，獲得了與直接標(biāo)記一致的強(qiáng)而特異的信號(hào)［5］。所建立流式細(xì)胞術(shù)分析方案可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)磷酸化激酶的敏感、快速分析。

［1］Stan D，Calin M，Manduteanu I，et al.High glucose induces enhanced expression of resistin in human U937monocyte－like cell line by MAPK－and NF－kB－dependent mechanisms；the modulating effect of insulin［J］.Cell Tissue Res，2011，343（2）：379.

［2］陳朱波，曹雪濤.流式細(xì)胞術(shù)：原理、操作及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2010.

［3］Feldman ME，Shokat KM.New inhibitors of the PI3K－AktmTOR pathway：insights into mTOR signaling from a new generation of Tor Kinase Domain Inhibitors（TORKinibs）［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010，347：241.

［4］Han Y，Guo Q，Zhang M，et al.CD69＋ CD4＋ CD25－T cells，a new subsetof regulatory T cells，suppress T cell proliferation through membrane－bound TGF－beta 1［J］.J Immunol，2009，182（1）：111.

［5］Albu DI，Califano D，Avram D.Flow cytometry analysis of transcription factors in T lymphocytes［J］.Methods Mol Biol，2010，647：377.