萬(wàn)廣穩(wěn)，張 研，劉 斌，劉晶晶，徐廣甍，喬士興

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041）

乳腺癌是嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣等的改變，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。研究結(jié)果顯示在25%－30%的乳腺癌中存在HER－2基因異常擴(kuò)增及其蛋白的過(guò)度表達(dá)［1，2］。HER－2陽(yáng)性的乳腺癌患者惡性程度高，預(yù)后差，該指標(biāo)已成為評(píng)價(jià)乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

目前靶向HER－2進(jìn)行基因治療方法有多種，如RNA干擾（RNAi）、反義寡核苷酸、抗HER－2疫苗、酪氨酸激酶抑制劑、細(xì)胞內(nèi)單鏈抗體等，其中應(yīng)用臨床并證明有效的藥物是曲妥珠單抗（TZB），其對(duì)HER－2陽(yáng)性乳腺癌的治療是革命性的成果，即使化療無(wú)效的乳腺癌患者應(yīng)用TZB治療仍部分有效，曲妥珠單抗聯(lián)合放化療大大提高了HER－2陽(yáng)性乳腺癌的有效率，延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間及減少?gòu)?fù)發(fā)率。目前我們通常根據(jù)免疫組化所測(cè)定的HER2蛋白表達(dá)情況或原位熒光雜交（FISH）所測(cè)定的HER2基因擴(kuò)增情況，來(lái)選擇是否采用曲妥珠單抗治療。然而，即使是HER2高表達(dá)或基因擴(kuò)增的患者，曲妥珠單抗有效率也僅為12%－34%，許多患者在接受治療的12個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)疾病進(jìn)展，如何提高曲妥珠單抗的有效率是目前需要解決的問(wèn)題。近來(lái)國(guó)外研究表明，自噬具有保護(hù)乳腺癌細(xì)胞免遭化療、缺氧、代謝應(yīng)激等導(dǎo)致的細(xì)胞死亡作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNAi減少微管相關(guān)蛋白1輕鏈3－β（LC3）表達(dá)來(lái)證明是否可以提高TZB對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 微管相關(guān)蛋白（LC3B）一抗為美國(guó)Signaling公司產(chǎn)品；羊抗兔及兔抗鼠二抗購(gòu)自北京中山金橋公司.赫賽汀，美國(guó)Genentech公司，儲(chǔ)存在4°C，濃度為21mg／ml。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株SKBR－3（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)），200μg／ml TZB誘導(dǎo)維持建立耐TZB的SKBR3細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基（含15%FBS及青霉素與鏈霉素各100U／ml），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶（0.2%EDTA）消化并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 構(gòu)建含目的基因的慢病毒載體 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找LC3的基因序列，按照siRNA設(shè)計(jì)原則，利用Ambion公司在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA序列，選出一個(gè)核苷酸序列針對(duì)LC3干擾靶點(diǎn)，進(jìn)行Blast基因同源性分析以保證基因沉默的特異性。

①靶序列：（基因序列1043－1061）：

5＇－GCTAGAGAGATCTCCCTAA－3＇

②無(wú)義對(duì)照目標(biāo)基因序列：

5＇－GACTTCATAAGGCGCATGC－3＇

用siRNA Hairpin寡核苷酸序列設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

將shRNA轉(zhuǎn)入到慢病毒中（構(gòu)建含有目的基因的慢病毒載體由上海吉瑪公司協(xié)助完成）。

1.4 目的基因轉(zhuǎn)染TZB抵抗的SKBR3乳腺癌細(xì)胞株 第一天：1.靶細(xì)胞鋪板24－well加入0.5×105cells／well，0.5ml完全培養(yǎng)液，37℃，5%CO2過(guò)夜；第二天：2.稀釋病毒：稀釋液400μl＋終濃度5 μg／ml Polybrene將慢病毒原液40ml加入稀釋液；3.移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入Step 2稀釋后的病毒液，同時(shí)建立對(duì)照，37℃，5%CO2過(guò)夜；第三天4.12－24小時(shí)移去細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的病毒液，加入0.5ml的完全培養(yǎng)液，37℃，5%CO2過(guò)夜；第四天：5.依據(jù)細(xì)胞的形態(tài)和類(lèi)型，加入0.5ml的完全培養(yǎng)液，37℃，5%CO2過(guò)夜；第六天：6.通過(guò)蛋白電泳及PCR檢測(cè)基因的表達(dá)及調(diào)控。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 以SKBR3乳腺癌細(xì)胞及SKBR3－TR細(xì)胞為研究對(duì)象，來(lái)研究LC3表達(dá)情況。以SKBR3－TR細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)分三組，一組SKBR3－TR細(xì)胞為正常組，一組慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi無(wú)義基因轉(zhuǎn)染SKBR3－TR細(xì)胞為陰性對(duì)照組（SKBR3－TR＋NC）；另外一組為慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi LC3轉(zhuǎn)染SKBR3－TR細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（SKBR3－TR＋LC3Ri）。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LC3mRNA的表達(dá) 根據(jù)Genbank中序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，目的基因引物序列 MAPLC3B：5′－CCTAGAAGGCGCTTACAGCT－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度186bp，內(nèi)參GAPDH引物序列：5′－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度138bp。收集細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA。取500ng總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA 4倍稀釋?zhuān)肧YBR染料法在PCR儀上擴(kuò)增，建立MAPLC3B的標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶解曲線及擴(kuò)增曲線。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5s；95℃變性5s，60℃退火20s，共45個(gè)循環(huán)。以陰性對(duì)照組為校正樣本，按照ΔΔCt解析法來(lái)進(jìn)行目的基因與管家基因的相對(duì)定量。

1.7 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，用1×PBS洗滌3次，每次1 500r／min離心5min，棄上清，加入適量冰預(yù)冷的含有PMSF單核細(xì)胞裂解液，冰浴30min，12 000r／min離心5 min，取上清移入新Ep管中。蛋白煮沸5min進(jìn)行變性，分別用10% 和12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂牛奶封閉1h，一抗作用4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X光膠片顯影，Quantity One軟件進(jìn)行電泳條帶灰度分析，以相應(yīng)蛋白條帶的平均灰度值與GAPDH蛋白平均灰度值的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.8 細(xì)胞存活率 細(xì)胞種在96孔板，（實(shí)驗(yàn)分組同前，同時(shí)加入SKBR3細(xì)胞作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔），種植密度4×103／孔。細(xì)胞種植24小時(shí)后加入200μg／ml曲妥珠單抗，96小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞活性。應(yīng)用Cell Counting Kit－8（CCK－8）（DOJINDO公司）試劑盒檢測(cè)，96孔板每孔加入100μg的培養(yǎng)液和10μg的CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀450nm處測(cè)量吸光度值.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，LC3mRNA與蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率均用Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SKBR3組與SKBR3－TR組LC3蛋白表達(dá)水平

結(jié)果提示耐TZB的SKBR3細(xì)胞組較正常組LC3的表達(dá)明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)2組細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)水平

2.2 不同SKBR3－TR細(xì)胞組LC3蛋白水平的變化

實(shí)驗(yàn)組LC3蛋白表達(dá)較正常組及陰性對(duì)照組明顯降低，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2），說(shuō)明LC3被成功沉默。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)3組細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)水平

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3組細(xì)胞中LC3mRNA的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組LC3蛋白表達(dá)較正常組及陰性對(duì)照組明顯降低，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖3），正常組與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在mRNA水平上證實(shí)LC3的沉默。

2.4 細(xì)胞存活率

CCK－8實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組LC3被沉默后，細(xì)胞存活率較正常組及陰性對(duì)照組明顯降低（見(jiàn)圖4），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明LC3在曲妥珠單抗治療HER2陽(yáng)性乳腺癌抵抗中發(fā)揮著重要的作用，正常組與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)3組細(xì)胞中LC3mRNA的表達(dá)水平

圖4 CCK－8檢測(cè)3組細(xì)胞存活率

3 討論

自噬性細(xì)胞死亡（Autophagic cell death簡(jiǎn)稱(chēng)自噬），屬于Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是除了凋亡以外的另一種程序性死亡方式，是真核細(xì)胞所共有的一種通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常蛋白、細(xì)胞器等以維持正常細(xì)胞功能的機(jī)制，而在細(xì)胞無(wú)法繼續(xù)維持自身生存時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡［3］。在腫瘤細(xì)胞中，自噬有兩方面的生理學(xué)功能，一方面，自噬是一種腫瘤抑制基因的機(jī)制，另一方面，自噬在腫瘤進(jìn)展中對(duì)抗各種微環(huán)境的變化，包括對(duì)各種抗癌療法的形成耐受［4］。

有一些腫瘤細(xì)胞有較高的自噬活性，自噬可以使腫瘤細(xì)胞耐受低營(yíng)養(yǎng)、缺氧、化療及放療等，從而延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞壽命，特別在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境發(fā)生巨大的變化，包括血供不足所造成的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、氧供等不足，腫瘤細(xì)胞可以依靠自噬作用將胞內(nèi)物質(zhì)降解和循環(huán)利用得以繼續(xù)存活。自噬缺陷可以使功能紊亂線粒體的聚集，增加有氧應(yīng)激對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的破壞，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生破壞［5］。在放療誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，常會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的輻射耐受現(xiàn)象，從而逃逸凋亡，達(dá)不到理想的治療效果。自噬通過(guò)去除受損的細(xì)胞器，保護(hù)腫瘤細(xì)胞以對(duì)抗抗癌治療比如放療、化療，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡［6］，自噬抑制后，可以增加化療的療效［7］。相關(guān)研究表明：提高自噬可減輕或者避免凋亡所引起的死亡，而抑制自噬則可有利于腫瘤細(xì)胞的凋亡［8］。

RNAi是利用生物體內(nèi)固有的機(jī)制，回避了其它方法帶來(lái)的不確定性，特異的抑制基因的表達(dá)，其具有特異性、長(zhǎng)度依賴(lài)性、快速性 、遺傳性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，在研究中已廣泛應(yīng)用，通過(guò)干擾某個(gè)基因來(lái)特異性的研究該基因的特性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特異性沉默LC3基因來(lái)檢測(cè)其作用。

曲妥珠單抗是一種人源化的P185胞外區(qū)的重組單克隆抗體，最早于1984年Drebin［9］等人提出，于1998年在美國(guó)批準(zhǔn)上市，它代表了一種對(duì)人類(lèi)疾病的分子靶向藥物的開(kāi)發(fā)成功和令人興奮的模型，它通過(guò)將自己附著在HER－2上來(lái)阻止人表皮生長(zhǎng)因子在HER－2的附著，進(jìn)而阻斷了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)還可以刺激自身的免疫細(xì)胞來(lái)殺死乳腺癌細(xì)胞。目前研究表明，HER2陽(yáng)性乳腺癌單抗耐藥有以下幾種機(jī)制：（1）細(xì)胞表面蛋白位阻HER2受體導(dǎo)致赫賽汀無(wú)法有效與 HER2結(jié)合；（2）HER2的下游信號(hào)通路上調(diào) HER2下游PI3K／Akt及Ras／MAPK信號(hào)通路持續(xù)活化；（3）替代信號(hào)通路：增加了其他受體的信號(hào)。胰島素樣生長(zhǎng)因子I型受體（IGF－IR）通路過(guò)度活化與赫賽汀耐藥有關(guān)；（4）受損的免疫介導(dǎo)機(jī)制［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白免疫印跡檢測(cè)LC3mRNA、蛋白的表達(dá)證明LC3被沉默，通過(guò)CCK－8檢測(cè)結(jié)果提示耐TBZ的乳腺癌細(xì)胞存活率明顯降低，說(shuō)明LC3在HER2陽(yáng)性乳腺癌對(duì)曲妥珠單抗抵抗過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而LC3是自噬的重要標(biāo)志，說(shuō)明自噬在引起TZB抵抗中可能發(fā)揮某種重要的調(diào)控機(jī)制。

目前被證實(shí)的可以抑制自噬的臨床相關(guān)的藥物相對(duì)較少，動(dòng)物腫瘤模型上的研究表明，自噬抑制劑有如質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑和順鉑，抗瘧疾藥物氯喹［11］等，隨著研究的深入這些藥物在未來(lái)的臨床試驗(yàn)中可能與曲妥珠單抗聯(lián)合，有助于提高曲妥珠單抗對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌治療的療效.

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