陳 曉，馬洪喜，李 丹，韓秀麗，張福明，白 歐＊

（吉林大學第一醫(yī)院1.腫瘤中心；2.臨床病理診斷中心，吉林 長春130021）

骨髓中主要存在兩種干細胞：造血干細胞（HSC）和間充質(zhì)干細胞（MSC），后者是具有多向分化潛能的干細胞，能分化為神經(jīng)細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞等［1］。它們均起源于中胚層細胞，MSC能否向造血干／祖細胞分化，在胚胎造血組織發(fā)生的研究過程中，不排除由正處于分化中及分化程度很低的幼稚MSC在一定的微環(huán)境的調(diào)控下向多能造血干細胞分化［2］。目前有關(guān)MSC向造血分化的研究相對較少，本實驗首先建立人骨髓MSC分離、培養(yǎng)及擴增體系，以hMSC注射于亞致死劑量射線照射后的裸鼠，觀察hMSC體內(nèi)造血分化潛能和造血重建能力，為hMSC作為干細胞移植供體來源的可能性和干細胞橫向發(fā)育的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取本院腫瘤中心健康志愿者骨髓，DMEM－LG、DMEM－HG、胎牛血清（FBS）、Percoll分離液（Phamacia），CD45－FITC、CD34－PE、CD29－PE、CD44－PE、CD90－FITC、CD105－PE（BD），BALB／C－nu／nu裸鼠，6－8周齡，體重18－20g，雌性，購自中科院上海實驗動物中心。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定

將無菌肝素化骨髓制備成單個核細胞（MNC），以1×106／ml的密度接種于培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長融合達90%時，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化傳代，傳至第4代（P4）后進行實驗。取P5代細胞，消化洗滌后制成1.0×106／ml的單細胞懸液，分別加入抗CD34、CD45、CD29、CD44、CD90、CD105單克隆抗體，F(xiàn)ACS檢測MSC表面抗原表達。

1.3 人骨髓間充質(zhì)干細胞在亞致死劑量射線照射BALB／C－nu／nu裸小鼠體內(nèi)的造血分化潛能

1.3.1 取生長良好的P5代hMSC，常規(guī)消化洗滌后，收集細胞濃度為（0.8－1）×107／ml。細胞分離后冰上保存，盡快輸注。

1.3.2 BALB／C－nu／nu裸鼠給予60Coγ射線全身照射，照射劑量為3.5Gy，照射劑量率為750cGy／min，照射后的裸鼠隨機進行分為2組，每組10只，6小時內(nèi)進行移植，實驗組輸注hMSC細胞，輸注量為（1.6－2）×106／只。對照組輸注PBS 0.2ml。

1.3.3 移植后每日觀察裸鼠外觀、活動狀況、毛發(fā)、大小便及攝食情況，每周測量體重，斷尾取血20μl進行白細胞計數(shù)。

1.3.4 骨髓病理及免疫組化分析 實驗組移植后存活至第8周的裸鼠或?qū)φ战M裸鼠在瀕死時摘除眼球放血處死，剪下雙側(cè)股骨骨骺端，脫鈣后，10%中性甲醛固定，石蠟包埋、脫水、透明，常規(guī)切片后HE染色，顯微鏡下觀察。骨髓病理切片以鼠抗人CD34和CD45單抗為標記進行免疫組織化學染色。

1.3.5 骨髓細胞粒－單／巨噬系集落形成單位（CFU－GM）的培養(yǎng) 處死裸鼠后剪下雙下肢，分離雙側(cè)股骨和脛骨，以IMDM培養(yǎng)液沖出骨髓細胞，加入含rhGM－CSF甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系，置于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)14天后，觀察集落形成情況。

1.3.6 FACS檢測人源細胞含量 取裸鼠1×106個骨髓細胞加入FITC－mouse anti hu CD45／PE－mouse anti hu CD34，同型對照為FITC－mouse IgG1／PE－mouse IgG1，流式細胞儀檢測，聯(lián)機專用軟件Cell Quest分析，結(jié)果以FITC－PE雙參數(shù)曲線圖表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增和鑒定

擴增后的hMSC呈梭形或多角形，成平行排列生長或漩渦狀生長，胞漿淡染，核大、居中，核染色質(zhì)粗，并可見雙核細胞。經(jīng)FACS檢測，成人骨髓來源的 MSC主要表達黏附分子CD29、CD44、CD90、CD105，不表達造血細胞表面標志CD34、CD45，細胞均一性達90%以上。

2.2 照射及移植后祼鼠外觀及白細胞計數(shù)

照射后裸鼠一般狀態(tài)較差，體形明顯消瘦，進食減少，毛色變暗，對照組從第2周至第4周，陸續(xù)死亡，而實驗組除3只意外死亡外，均存活至8周，實驗組裸鼠9－12d后狀態(tài)逐漸恢復至正常。照射后第1周兩組裸鼠白細胞數(shù)明顯下降，對照組裸鼠白細胞數(shù)呈持續(xù)下降趨勢，直至全部死亡。實驗組裸鼠白細胞數(shù)在第2周開始恢復，至第6周白細胞計數(shù)恢復正常。

2.3 對移植后存活8周和對照組的裸鼠進行骨髓病理學分析

實驗組裸鼠骨髓增生活躍，可見各期幼稚細胞。對照組裸鼠骨髓病理顯示骨髓細胞增生低下，造血面積減少，非造血細胞增多（圖1－2）。免疫組化結(jié)果表明實驗組小鼠的骨髓中可以檢測到CD34陽性和CD45陽性的細胞，細胞呈局灶性分布，陽性細胞胞漿及胞膜呈棕黃色（圖3－4）。而對照組裸鼠的骨髓細胞中未檢測到陽性細胞。

2.4 骨髓細胞粒－單／巨噬系集落形成單位（CFUGM）的培養(yǎng)結(jié)果

實驗組裸鼠的骨髓細胞在含rhGM－CSF甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系培養(yǎng)14天后，可見少量的密集型集落形成（圖略）。

2.5 FACS檢測人源細胞含量

經(jīng)流式細胞儀分析，實驗組裸鼠骨髓中可以檢測到CD34陽性和CD45陽性的細胞，陽性百分率分別為4.63%±0.57%和0.87%±0.12%（圖略），而對照組未檢測到CD34陽性和CD45陽性的細胞。

3 討論

大量的研究證實，成體干細胞不僅僅是一種“定向干細胞”（Commited stem cells），即只能分化為其所起源或定居組織的特定細胞類型，同時它能夠分化為其他組織細胞類型。研究表明，MSC已不再局限于其支持和維持體內(nèi)外造血的功能［3］，不僅可在體內(nèi)、體外分化為中胚層來源的細胞，也可以分化為外胚層來源的神經(jīng)樣細胞，而且在一定的微環(huán)境的調(diào)控下向多能造血干細胞分化，發(fā)育成各系造血細胞，但應(yīng)有適合于復制和分化的基質(zhì)即“生態(tài)龕”的存在［2］。推測MSC可能是造血細胞和基質(zhì)細胞的公共干細胞（Common stem cells），即MSC同樣具有向造血細胞分化的潛能。呼瑩等將擴增后的雄性小鼠骨髓MSCs輸注給預先經(jīng)致死劑量照射的雌性小鼠，輸注后的第3周，外周血和骨髓中的有核細胞都明顯恢復，數(shù)天后通過PCR方法特異性地擴增Y染色體的sry基因，確定在重建造血的小鼠體內(nèi)，造血細胞大部分來源于供體 MSC［4］。Porada等研究發(fā)現(xiàn)將表型為 CD90＋、CD44＋、CD29＋、CD106＋、CD45－、STRO－1＋MSC進行羊?qū)m內(nèi)羊胎移植，借助于胚胎微環(huán)境，MSC能分化為造血細胞和肝細胞，盡管檢出率不高，但這種MSC來源的細胞能在體內(nèi)存活長達半年以上而無任何毒性反應(yīng)［5］。

圖1 實驗組裸鼠骨髓病理（×100）

圖2 對照組裸鼠骨髓病理（×100）

圖3 實驗組骨髓病理免疫組化CD34陽性（×1000）

圖4 實驗組骨髓病理免疫組化CD45陽性（×1000）

本實驗將體外分離擴增的hMSC移植給亞致死劑量照射后的裸鼠，移植后第1周裸鼠白細胞數(shù)值下降明顯，實驗組移植后第6周，外周血白細胞明顯恢復并接近正常水平。骨髓病理結(jié)果顯示，移植后8周，實驗組裸鼠骨髓細胞增生活躍，可見各個階段的細胞。同時我們以CD34、CD45作為標記，通過FCM、免疫組化的方法檢測人源性造血細胞的植入情況，結(jié)果表明實驗組骨髓可以檢測到CD34和人CD45陽性的細胞，體外造血祖細胞集落培養(yǎng)結(jié)果也進一步證實移植受體小鼠骨髓中存在人源性造血干／祖細胞。說明hMSC能在亞致死劑量射線照射的裸鼠骨髓中植入并分化表型為人CD34＋的造血干／祖細胞，重建造血。

HSCT作為一種重要的生物或細胞治療，盡管已取得了令人鼓舞的臨床療效，但供源不足、原始造血干細胞能否大量擴增仍存爭議以及移植物中腫瘤細胞的污染等使得HSC在數(shù)量和質(zhì)量上遠不能滿足臨床的需要。相比之下，MSC來源廣、易于分離和體外培養(yǎng)，并且在體外易于大量擴增，本研究結(jié)果證實MSC可以分化為造血細胞，MSC以貼壁的方式生長，而白血病細胞主要以懸浮的方式生長，那么，我們可以從白血病患者骨髓中分離出MSC，通過貼壁和體外反復消化傳代培養(yǎng)，大量擴增的同時也可清除移植物中的白血病細胞以達到凈化移植物的目的，MSC不僅可分化為造血干／祖細胞重建造血，而且能在一定程度上減少術(shù)后復發(fā)，因此MSC有望成為HSC的新來源，MSC移植將具有更廣泛的應(yīng)用前景。

［1］Yuchua J，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］.Nature，2002，418（6893）：41.

［2］施斐曼，劉 永.造血干細胞發(fā)生學研究－人胚肝造血干細胞［J］.細胞生物學雜志，1982，4：15.

［3］Linzhao CH，Qasba P，Vanguri P，et al.Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro－platelet formation from CD34＋ hematopoietic progenitor cells［J］.Cell Physiol，2000，184（1）：58.

［4］呼 瑩，馬 麗，馬冠杰，等.具骨髓間充質(zhì)干細胞表型的成體干細胞移植造血［J］.中國醫(yī)學科學院學報，2002，24（1）：20－24.

［5］Porada GA，Brouard N，et al.Generation of hematopoietic and hepatic cells by human bone marrow stromal cells in vivo［J］.Blood.2001，96（11）：57.