李 丹，崔久嵬，蒿姍姍，牛 超，Aadil Yousif，李 薇

（吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是最為常見的血液系統惡性腫瘤之一，發(fā)生率占血液系統惡性腫瘤的10%左右，隨著人口的老齡化，該病的發(fā)生率在我國呈逐年增高的趨勢。三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）在體外對多種實體瘤和血液腫瘤細胞系，包括MM 細胞系均有作用，但其機制尚未完全清楚［1、2］。為了揭示ATO對多發(fā)性骨髓瘤細胞系的作用機制，本研究分別對細胞增殖、凋亡、細胞周期、VEGF分泌和Bcl－2［3］表達情況等方面進行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

三氧化二砷（sigma公司）、IMDM培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco公司），6孔及96孔板培養(yǎng)板（Coring公司）；CCK－8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒 （武漢博士德）；ELISA檢測試劑盒（R＆D公司）；Bcl－2、β－actin、鼠抗人－抗多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔抗鼠二抗多克隆抗體（中杉金橋）；Western blot試劑盒（KPL公司）；FACScan型流式細胞儀（BD公司）；酶標儀（BIO－TEK公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) RPMI8226細胞株購自ATCC，懸浮培養(yǎng)于IMDM 培養(yǎng)液（內含2mmol／L L－谷氨酰胺、10%的滅活胎牛血清、100U／ml青霉素、100 mg／ml鏈霉素）中，置于5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48h傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK－8法檢測ATO作用后細胞生長情況

收集對數生長期的RPMI8226細胞，調整細胞懸液濃度為5×105個／ml，接種于96孔板。每孔100 μl。實驗設溶質對照組，細胞不加藥組以及細胞加ATO組（ATO 終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μmol／L）共七組，每組設3個復孔。將各組細胞培養(yǎng)至12h、24h、48h后，每孔加入10μl CCK－8，于5%CO2飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后在酶聯免疫檢測儀450nm處測量各孔的吸光值。取3孔的平均值，計算細胞生長抑制率，繪制細胞生長抑制曲線。實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞儀Annexin V／PI染色法檢測細胞周期及凋亡情況 收集對數生長期的RPMI8226細胞，配成1×106／ml的細胞懸液，接種于6孔板，3 ml／孔。各孔分別加入不同濃度 ATO（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μmol／L）及PBS（作為對照），培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，制備成100μl單細胞懸液于流式管中，加入5μl Annexin－Ⅴ和10μl PI染液，同時設熒光補償管，暗室反應15min，再加入150μl結合緩沖液，于1h內流式細胞儀檢測。每組實驗均重復3次。

1.2.4 用ELISA法檢測不同濃度 ATO對RPMI8226細胞分泌VEGF的影響 收集不同濃度ATO作用RPMI8226細胞48h后上清液，進行稀釋后，按照VEGF ELISA檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 Western blot檢測 ATO 作用后 Bcl－2蛋白水平檢測 RPMI8226細胞于含10%滅活胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，根據加入ATO的濃度的不同，共分為六組，即：空白不加藥組和ATO終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μmol／L組。各組作用24h及48h后，分別收集各時間點細胞，4℃預冷的PBS洗滌2次，加入細胞蛋白提取液，冰浴10－30min后，12 000rpm，4℃低溫離心5min。取上清，經Bradford分析方法定量。細胞蛋白提取液樣品（約50μg）溶于樣品緩沖液中，混勻，沸水中熱溶5min。取等量的蛋白進行SDS－PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，漂洗后加入相應的一抗，4℃孵育過夜，漂洗后二抗孵育1h，用ECL發(fā)光液顯色、曝光、顯影、定影、水洗。X光片曝光處理，計算機軟件分析結果。以β－actin為內參照，統計數據以供分析。

1.2.6 統計學方法 用SPSS13.0統計軟件分析，采用單因素方差分析（F檢驗）和LSD－t檢驗進行多樣本均數的兩兩比較。取α＝0.05為檢驗水準，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226增殖的影響

CCK－8法檢測ATO作用后細胞增殖后OD值，計算抑制率（圖1）。并觀察不同作用時間下，ATO對細胞的抑制作用。ATO對RPMI 8226細胞株的增殖抑制呈劑量－時間依賴性，即：劑量越大，時間越長，抑制率越高。其中，ATO濃度為5.0 μmol／L時，12h對細胞的抑制率為51.7%，同濃度24h及48h抑制率分別為61.6%，80.2%。不同濃度ATO（1.0－5.0μmo／L），以24h為例，ATO對細胞的抑制率從42.9%升至61.1%。

圖1 ATO抑制RPMI8226細胞抑制率曲線

2.2 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞周期變化

選取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0（μmol／L）ATO 作用于RPMI8226細胞48h為例，選用各自未加藥組細胞為對照，AnnexinⅤ／PI法，檢測細胞周期變化情況（見表2）。流式細胞檢測結果分析，隨著ATO濃度的增加，G1期細胞數逐漸增多，提示ATO將RPMI8226細胞阻滯在G1期（如表2）。

表2 流式細胞儀檢測不同濃度ATO作用48h后細胞周期變化

2.3 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226凋亡的影響

選取1.0，2.0，5.0μmol／L的ATO作用于RPMI8226細胞24h、48h兩個時間點，各自選用未加藥細胞組為對照，AnnexinⅤ／PI法，檢測細胞凋亡情況（見圖2及圖3）。結果提示ATO可誘導RPMI8226細胞凋亡，1.0μmol／L的ATO在24h誘導細胞凋亡率是15.69%，相同濃度在48h是26.33%；5.0μmol／L組24h凋亡率為27.61%，48 h則為39.47%。與各自的空白組相對比，ATO誘導RPMI8226細胞凋亡，呈時間依賴性和濃度依賴性，P＜0.05，有統計學意義。

圖2 不同濃度ATO作用細胞24h后細胞凋亡情況

圖3 不同濃度ATO作用細胞48h后細胞凋亡情況

2.4 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226自分泌VEGF的影響

ATO作用于人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226后，利用ELISA技術檢測ATO作用RPMI8226細胞48h后，對細胞VEGF合成的影響。如表3所示：隨著ATO藥物濃度升高，VEGF表達及分泌量越少，與對照組相比，P＜0.01，有統計學意義。

2.5 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226抗凋亡蛋白Bcl－2表達的影響

為了進一步研究ATO抑制多發(fā)性骨髓瘤RP MI8226細胞增殖的機制，我們檢測了細胞內抗凋亡蛋白Bcl－2的水平。結果提示，隨著ATO濃度升高及作用時間的延長，細胞內Bcl－2蛋白表達下降（如圖4）。

表3 As2O3對RPMI8226細胞VEGF轉錄和分泌的影響（±s）

表3 As2O3對RPMI8226細胞VEGF轉錄和分泌的影響（±s）

注：與對照組比較，＊＊P＜0.01

組別 VEGF（ng／L）Ctrol 865.6±32.5 1mol／L As2O3 583.5±28.6＊＊2mol／L As2O3 471.3±26.1＊＊3mol／L As2O3 305.6±19.4＊＊4mol／L As2O3 238.1±27.1＊＊5mol／L As2O3 101.3±22.3＊＊

圖4 ATO作用24、48h后RPMI8226細胞內Bcl－2表達水平

2.6 ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226ERK1／2及其磷酸化蛋白表達的影響

本實驗進一步研究ATO作用于RPMI8226細胞后ERK變化情況。我們選取ATO處理后48h，ATO 終濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μmol／L六個組，并以β－actin為內參照，利用 Western blot法檢測RPMI8226細胞內ERK1／2蛋白及其磷酸化蛋白表達量。結果顯示，各組細胞均有ERK1／2蛋白表達，組間比較表達量無明顯差異（如圖5）。

圖5 ATO作用48h后RPMI8226細胞內ERK表達水平

3 討論

目前，ATO已用于復發(fā)和難治性MM的治療，并取得可靠療效。體外實驗研究表明，ATO是通過不同的途徑，對不同的多發(fā)性骨髓瘤細胞系的進行抑制，從而誘導MM 細胞凋亡，包括 MAPK途徑、JAK／STAT 途徑，線粒體凋亡途徑等［4、5］。對于ATO作用于MM細胞凋亡的機制，國內外實驗結論各不相同，尚存在很大爭議。

本實驗應用CCK－8法，對不同濃度ATO作用細胞12h、24h、48h后，檢測ATO對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞系有明顯抑制作用，其作用呈時間依賴和濃度依賴性。并且ATO能夠誘導人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡，其作用同樣具有時間依賴和濃度依賴的，ATO將RPMI8226細胞阻滯在G1期。

骨髓瘤細胞可以分泌VEGF，并且VEGF分泌水平與腫瘤不同療效及預后之間存在著密切的聯系［6］。高水平VEGF是療效不佳的影響因素之一，VEGF可以直接促進骨髓瘤細胞生長，證明VEGF還可以通過自分泌途徑促進腫瘤細胞生長。我們應用ATO作用于人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226，觀察其對瘤細胞VEGF合成分泌的影響，結果顯示ATO可抑制RPMI8226細胞VEGF的分泌，提示此可能也是ATO抑制RPMI8226細胞生長的機制之一。

本研究顯示：經不同時間，不同濃度ATO作用后，RPMI8226細胞ERK及磷酸化ERK水平未見明顯變化。隨著ATO作用濃度與時間的延長，Bcl－2水平明顯下降，且呈時間及劑量依賴性，因此，提示ATO促進多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡作用主要是通過下調 Bcl－2來實現的［7］。Bcl－2其對細胞的作用并不影響細胞的增殖，而是通過抑制細胞凋亡從而增加了腫瘤發(fā)生的機會并促進腫瘤的發(fā)展［8］。

總之，體外實驗表明ATO具有抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖及VEGF表達。其可能的機制為ATO將RPMI8226細胞阻滯在G1期，Bcl－2基因功能的下調也可能是重要的機制。ATO對RPMI8226細胞的這種抑制作用，表明其可能是一種很好的抗多發(fā)性骨髓瘤的藥物，值得進一步動物實驗及臨床研究。

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