王 磊，程鶴香，趙 倩，陳 鷗，趙 明＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.佳木斯市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉科）

喉癌是東北的高發(fā)癌癥之一，其主要的治療方法主要是手術(shù)、放化療等。其病因主要與吸煙相關(guān)，可能的機(jī)制是吸煙產(chǎn)生的毒性致癌物質(zhì)導(dǎo)致的線粒體DNA損傷所致。近年研究發(fā)現(xiàn)在許多人類腫瘤中有大量的線粒體基因組缺陷，線粒體基因組改變的頻率非常高，包括膀胱、頭頸、肺和乳腺、前列腺腫瘤等。體細(xì)胞線粒體DNA突變被認(rèn)為是腫瘤早期發(fā)生的標(biāo)志。線粒體DNA突變是否參與腫瘤形成及尋找線粒體中的體細(xì)胞突變是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)［1－3，14］。

研究喉癌的線粒體功能和突變，需要有喉癌細(xì)胞的線粒體缺失細(xì)胞，由于線粒體缺失細(xì)胞系的構(gòu)建非常困難，所以一直以來人們利用1989年由Attardi構(gòu)建的無線粒體的骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行線粒體功能研究，但是不同種類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)，分化突變特點(diǎn)等均有特異性，如果進(jìn)行喉癌線粒體功能的研究，能有線粒體DNA缺失的人喉癌細(xì)胞系，是非常重要的［4－7］。我們構(gòu)建線粒體缺失的喉癌細(xì)胞，為后續(xù)構(gòu)建融合喉癌細(xì)胞、線粒體突變和線粒體功能研究提供細(xì)胞模型，同時(shí)也為研究線粒體DNA突變和喉癌發(fā)生之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用人穩(wěn)定傳代喉癌細(xì)胞系JHUo11作為母本細(xì)胞，通過低劑量溴化乙錠持續(xù)作用于該細(xì)胞，誘導(dǎo)線粒體缺失DNA，成功制備出ρ0（無線粒體）細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司；溴化 乙錠 （ethidium bromide，EtBr，EB）、丙酮酸（pyruvate）、尿苷（urideine）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟生物基因科技有限公司；PTC200 PCR儀 ；TECNAI10透射電子顯微鏡；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 ρ0細(xì)胞的構(gòu)建

人喉癌細(xì)胞o11在加10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長(zhǎng)良好后開始進(jìn)行ρ0細(xì)胞的構(gòu)建。將生長(zhǎng)良好的喉癌細(xì)胞o11分裝在4個(gè)培養(yǎng)盤中，并標(biāo)號(hào)。細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)長(zhǎng)期培養(yǎng)，期間約2d換液1次，3～4d或細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)傳代1次。每次換液或傳代時(shí)各個(gè)序號(hào)的培養(yǎng)盤加入丙酮酸、尿苷。加或不加溴化乙錠。見表1。

表1 四組o11細(xì)胞加入藥品列表

1.3 無mtDNA的細(xì)胞系鑒定

1.3.1 光鏡下觀察無線粒體細(xì)胞系及生長(zhǎng)缺陷的鑒定 將經(jīng)EB處理90天后的人喉癌細(xì)胞o11換用含10%胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)（不含丙酮酸鈉和尿嘧啶），每2－4天換液1次，與同批非選擇培養(yǎng)的人喉癌細(xì)胞作對(duì)照，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)及死亡情況。

1.3.2 PCR檢測(cè) 將各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心收集細(xì)胞。參照試劑盒提供的操作說明進(jìn)行。將全基因組DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因?yàn)榫€粒體DNA上任選一段序列，正向引物為（5’－GGTCTATCACCCTATTAACCAC－3’）（nt 8－29）；反向引物為（5’－CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA－3’）（nt 408–429），擴(kuò)增產(chǎn)物為420bp。反應(yīng)體系按操作說明書設(shè)定，按以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性94℃5min，然后變性94℃30s，復(fù)性55℃30s，延伸72℃1.5min共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠電泳分析。在1號(hào)細(xì)胞中有線粒體編碼的基因雜交條帶顯示，而在線粒體DNA完全缺失的細(xì)胞株中（3號(hào)）無相應(yīng)雜交條帶顯示。電泳液為TBE緩沖液，電泳1.5h，紫外燈下觀察并拍照。

1.3.3 健那綠染色活細(xì)胞 健那綠（Janu’s Green B）（sigma公司）是脂溶性的堿性染料，是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料，可使線粒體呈現(xiàn)藍(lán)綠色，而細(xì)胞質(zhì)接近無色，毒性很小，通常線粒體的鑒定用健那綠活染法。配制1%健那綠染液：將0.5g健那綠溶解于50mL生理鹽水中，加溫到30－40℃，使其充分溶解。將1號(hào)對(duì)照盤細(xì)胞和經(jīng)過PCR鑒定的3號(hào)盤細(xì)胞分別放入35mm的培養(yǎng)盤中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%時(shí)加入1%健那綠2滴，等2－5分鐘后置于高倍光鏡下觀察。

2 結(jié)果

人喉癌細(xì)胞培養(yǎng)良好后開始進(jìn)行mtNDA耗損實(shí)驗(yàn)，1號(hào)培養(yǎng)盤為不加EB的對(duì)照細(xì)胞，平均每?jī)扇招鑲鞔淮?。?xì)胞生長(zhǎng)速度最快。2號(hào)培養(yǎng)盤中的細(xì)胞在含有50ng／ml EB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)較為迅速，平均每3天即可傳代，2號(hào)培養(yǎng)盤中的細(xì)胞增殖較3號(hào)培養(yǎng)盤中的細(xì)胞快，3號(hào)培養(yǎng)盤細(xì)胞加入75 ng／ml溴化乙錠，細(xì)胞增殖較慢，需每4天換液。持續(xù)作用90天后成功構(gòu)建。4號(hào)培養(yǎng)盤中加入EB100ng／ml，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最慢，需一周傳代一次，培養(yǎng)至2周時(shí)細(xì)胞80%以上懸浮死亡。每組細(xì)胞、、細(xì)胞在加EB初期死亡細(xì)胞明顯增多，生長(zhǎng)速度減慢，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)EB的毒性效應(yīng)逐漸耐受，死亡細(xì)胞逐漸減少。細(xì)胞在溴化乙錠的慢性毒性作用過程中，光鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變大，變圓，透光度增加，見圖1，2。

將1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)盤中的細(xì)胞全基因組DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的基因?yàn)榫€粒體上的基因片段約420bp，PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組1號(hào)培養(yǎng)盤擴(kuò)增出目的片段位于500bp附近，3號(hào)盤未擴(kuò)增出，2號(hào)盤擴(kuò)增出500bp的片段，顏色比1號(hào)盤明顯變淺，因此可證實(shí)3號(hào)培養(yǎng)盤細(xì)胞中mtDNA已被完全去除，見圖3，左起第一為DNA marker，依次是3號(hào)盤細(xì)胞，1號(hào)盤，2號(hào)盤。2號(hào)盤的細(xì)胞經(jīng)EB處理后，其中的線粒體DNA已大部分消失，但由于EB濃度較低還不足以將線粒體DNA完全去除，故表現(xiàn)為弱淺條帶。而4號(hào)盤由于EB濃度過高，喉癌細(xì)胞系o11不能耐受EB的毒性，故2周內(nèi)逐漸死亡。

圖1 光鏡下未加EB的o11細(xì)胞

圖2 光鏡下加EB 90天的o11細(xì)胞

圖3 處理90天后各組細(xì)胞線粒體DNA的PCR結(jié)果

將已經(jīng)去除線粒體的3號(hào)盤細(xì)胞1：2傳代分裝在3a盤和3b盤中。兩盤細(xì)胞均不加EB，3a盤中細(xì)胞在加丙酮酸及尿苷培養(yǎng)液中培養(yǎng)，濃度及量同前。3b盤中細(xì)胞在不加丙酮酸及尿苷培養(yǎng)液中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3a盤中的細(xì)胞在有丙酮酸及尿苷的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。而3b盤中細(xì)胞在無丙酮酸及尿苷的培養(yǎng)基中第1天開始細(xì)胞逐漸懸浮、腫脹至第三天死亡。這種嘧啶和丙酮酸依賴性說明，線粒體DNA已耗盡。

健那綠是脂溶性的堿性染料，易于被細(xì)胞吸收，是對(duì)線粒體專一的活細(xì)胞染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)）呈藍(lán)綠色而使線粒體顯色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。1號(hào)盤細(xì)胞是未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞，線粒體正常存在，健那綠染色后可見藍(lán)綠色散在線粒體分布，而3號(hào)盤中未見藍(lán)綠色染色體。見圖4和圖5。由于健那綠對(duì)線粒體有專一性，進(jìn)一步證實(shí)3號(hào)盤細(xì)胞為無線粒體的ρ0細(xì)胞。

3 討論

目前對(duì)于無線粒體細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法較多，較經(jīng)典的是溴化乙錠誘導(dǎo)法，其他的有抑制呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ的魚藤酮及抗癌藥物地特氯銨誘導(dǎo)法、抗愛滋病藥物雙脫氧胞苷誘導(dǎo)法、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)法［4，6，10］。

圖4 未加EB處理的o11細(xì)胞（健那綠染色）

圖5 加EB 90天后的o11細(xì)胞（健那綠染色）

無線粒體細(xì)胞（ρ0）是通過長(zhǎng)期暴露于低濃度的溴化乙錠而建立的，溴化乙啶可以與mtDNA的雙鏈較牢固結(jié)合，抑制細(xì)胞分裂時(shí)的mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞分裂后mtDNA數(shù)量每次減少1／2，逐次減少，數(shù)量表示為原來數(shù)量的1／2n。由于細(xì)胞線粒體內(nèi)有限的mtDNA拷貝，當(dāng)分裂次數(shù)n足夠大時(shí)，數(shù)量的1／2n將接近零，即細(xì)胞線粒體內(nèi)沒有有效的 mtDNA［5，9］。

溴化乙錠耗損mtDNA的劑量和作用時(shí)間在不同的細(xì)胞差別較大，劑量從25ng／ml到5μg／ml不等，處理時(shí)間由20多天到210多天。細(xì)胞ρ0是一類完全缺少mtDNA的細(xì)胞。自從King和Attardi利用骨肉瘤細(xì)胞構(gòu)建出第一個(gè)人類ρ0細(xì)胞后，目前已有多種類型的細(xì)胞ρ0產(chǎn)生，如 HeLa細(xì)胞、SKHep1細(xì)胞、肺癌細(xì)胞系等ρ0細(xì)胞，但仍有許多細(xì)胞株不能被誘導(dǎo)成功［4，14］。判斷一種細(xì)胞是否能培養(yǎng)成ρ0細(xì)胞，將細(xì)胞用EB處理一定時(shí)間后，將均加入相等的丙酮酸鈉及尿嘧啶。２、３、４號(hào)盤中的養(yǎng)，若細(xì)胞在無尿嘧啶的培養(yǎng)基中逐漸懸浮、腫脹，死亡，而在有尿嘧啶的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，則該細(xì)胞具有較強(qiáng)的培養(yǎng)成ρ0細(xì)胞的潛力；如果兩種培養(yǎng)基中細(xì)胞均正常生長(zhǎng)，則該細(xì)胞可能對(duì)藥物有耐性，不能失去mtDNA，很難培養(yǎng)成細(xì)ρ0胞；如果兩種培養(yǎng)基中細(xì)胞均死亡，也不可能培養(yǎng)成ρ0細(xì)胞［11－13］。

線粒體DNA缺失細(xì)胞系，其原理可抑制整個(gè)胞漿中的線粒體DNA的復(fù)制，但不影響核DNA復(fù)制。無二氫乳氫酸脫氫酶活性，具有尿嘧啶和丙酮酸依賴性，利用丙酮酸通過糖酵解途徑獲得能量，需補(bǔ)充外源性丙酮酸和尿苷來維持其生存［5，11，12］，還能夠接受外源性線粒體DNA發(fā)揮作用［10］。本實(shí)驗(yàn)選用75μg／ml的濃度來耗損mtDNA，間隔一段時(shí)間采用光鏡和PCR擴(kuò)增檢測(cè)人喉癌細(xì)胞mtDNA耗損的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在耗損開始階段死亡的較多，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)死亡細(xì)胞逐漸減少，細(xì)胞逐漸適應(yīng)了培養(yǎng)基的生長(zhǎng)環(huán)境，經(jīng)過大約90天就成功構(gòu)建出ρ0細(xì)胞。

ρ0細(xì)胞的篩選非常困難，不易獲得成功，即使成功，至少要幾個(gè)月的時(shí)間，國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)無線粒體喉癌細(xì)胞系構(gòu)建的文章。線粒體DNA突變與頭頸腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，ρ0細(xì)胞因缺乏mtDNA可以用來構(gòu)建出各種胞質(zhì)雜交融合細(xì)胞（cybrid），建立喉癌線粒體基因改變模型，我們可以利用該細(xì)胞研究相同的核遺傳背景下不同線粒體DNA分子的基因改變及功能變化，為喉癌的發(fā)生機(jī)制和線粒體DNA突變的相關(guān)性的研究奠定基礎(chǔ)。

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