陳 昕，趙 雷，韓蘊(yùn)琪，孫 波，石 毅，周余來(lái)

（1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518020；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院 生物工程教研室，吉林 長(zhǎng)春130021）

在人體的許多生理過(guò)程之中都有自由基的參與。心肌細(xì)胞是一種對(duì)自由基毒性敏感的組織，因?yàn)樗胸S富的酶和膜組織，二者都易被自由基所破壞。在多種心肌細(xì)胞損傷的情況下，均發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)有過(guò)量的自由基的產(chǎn)生［1，2］。因此，能夠清除自由基，減輕過(guò)氧化損傷的藥物即可對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。維生素E能清除體內(nèi)的自由基，是一種常用的抗氧化藥物［3］。本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證維生素E對(duì)阿霉素產(chǎn)生的心肌細(xì)胞過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

實(shí)驗(yàn)使用新生 Wistar大鼠，清潔級(jí)，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)：NO：0010281）；新生小牛血清由Gibco公司提供；MEM培養(yǎng)基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；鹽酸阿霉素為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；山莨菪堿為天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDHI）測(cè)定試劑盒、一氧化氮合成酶（NOS）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒為南京建成生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培養(yǎng) 取新生Wistar大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液中，加入10%滅活胎牛血清，細(xì)胞濃度1×105／ml，每孔200μl接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后，觀察細(xì)胞，當(dāng)心肌細(xì)胞貼壁后，換液。在培養(yǎng)48h后，可見心肌細(xì)胞連接成片，并產(chǎn)生有節(jié)律的自主跳動(dòng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模給藥方法 約48h之后，將培養(yǎng)細(xì)胞分組給藥。空白對(duì)照組加MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組加阿霉素濃度為2μg／ml的 MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；藥物保護(hù)組分設(shè)3種濃度梯度分別加150μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素、300μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素和600μg／ml維生素E＋2μg／ml阿霉素。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 心肌細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)以及細(xì)胞的搏動(dòng)率。

1.3.2 細(xì)胞損傷生化指標(biāo)測(cè)定 在心肌細(xì)胞給藥培養(yǎng)48h后，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)培養(yǎng)液上清LDH和NOS含量；檢測(cè)培養(yǎng)心肌細(xì)胞超聲破碎得到細(xì)胞混懸液檢測(cè)MDA的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS V13.0進(jìn)行處理。多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

在細(xì)胞貼壁24h后，即可見心肌細(xì)胞已連結(jié)成片，有自主有規(guī)則的搏動(dòng)。在給藥之后，分別觀察空白對(duì)照組、損傷組和藥物修復(fù)組，發(fā)現(xiàn)組間已具有明顯的形態(tài)差異：.空白對(duì)照組（見圖1）：心肌細(xì)胞成多邊形生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞邊緣清晰，相互通過(guò)偽足連接成片，細(xì)胞間有相互偶聯(lián)的自主搏動(dòng)，搏動(dòng)穩(wěn)定；模型組（見圖2）：模型組形態(tài)改變明顯，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞的邊緣不清晰，自主節(jié)律跳動(dòng)消失，細(xì)胞間的連接被破壞，偶見漂浮的細(xì)胞；修復(fù)組心肌細(xì)胞（見圖3）：多數(shù)細(xì)胞邊緣清晰，仍有自主搏動(dòng)，但部分細(xì)胞可見邊緣模糊，自主搏動(dòng)消失等破壞現(xiàn)象。

圖1 空白對(duì)照組的心肌細(xì)胞（×100）

圖2 阿霉素組的心肌細(xì)胞（×100）

圖3 維生素E修復(fù)組的心肌細(xì)胞（×100）

2.2 維生素E對(duì)阿霉素造成的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

各組細(xì)胞給藥后培養(yǎng)達(dá)48h時(shí)，阿霉素?fù)p傷組心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、NOS和MDA含量明顯增加，與正常組比較差異非常顯著（P＜0.01）；藥物保護(hù)組的LDH、NOS和MDA含量較阿霉素?fù)p傷組降低，差異明顯（P＜0.01或P＜0.05）且降低呈現(xiàn)劑量依賴性。見表1。

表1 維生素E對(duì)阿霉素引起的心肌細(xì)胞損傷的作用

3 討論

自由基是一種機(jī)體代謝的中間產(chǎn)物，是能獨(dú)立存在的含有一個(gè)或一個(gè)以上的不配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)。它有很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，可以產(chǎn)生連鎖反應(yīng)損傷機(jī)體。它所造成的損傷主要有破壞核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生基因突變；使不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化；使蛋白質(zhì)和糖類等大分子發(fā)生交聯(lián)。伴隨著這些生物大分子結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞的代謝活動(dòng)會(huì)受到較大的影響，如阻礙呼吸作用中的電子鏈傳遞，引起細(xì)胞凋亡，破壞離子轉(zhuǎn)運(yùn)，改變細(xì)胞內(nèi)液成分等等。

阿霉素是臨床上廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，由于其特定的結(jié)構(gòu)，在進(jìn)入心肌細(xì)胞后分別在微粒體和線粒體中產(chǎn)生O2、OH、H2O2等氧自由基，作用于心肌細(xì)胞膜及各種細(xì)胞器膜上磷脂中的多價(jià)不飽和脂肪酸，形成脂質(zhì)自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并影響膜上功能蛋白質(zhì)的位置及構(gòu)型，最終導(dǎo)致膜的完整性遭到破壞，膜的流動(dòng)性降低，通透性增加，容量調(diào)節(jié)功能及離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙［4］。另外，阿霉素使心肌細(xì)胞主要的抗氧自由基酶活性降低，而不能有效地保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧自由基的損傷。因此心臟毒性是阿霉素最為主要的副作用之一，這嚴(yán)重制約了它在臨床的應(yīng)用?？梢妼ふ矣行У囊种瓢⒚顾匦呐K毒性的藥物在臨床具有重要的意義。

維生素E是細(xì)胞內(nèi)存在的高效自由基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化作用的阻斷劑。研究證明，它能夠有效的保護(hù)心血管系統(tǒng)減少心血管病的發(fā)病率［5，6］，對(duì)克山病、缺血再灌注損傷均有療效［7］。在本實(shí)驗(yàn)以心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，體外以阿霉素誘導(dǎo)損傷構(gòu)建細(xì)胞病理模型，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、乳酸脫氫酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面觀察了維生素E對(duì)ADM中毒心肌細(xì)胞的保護(hù)。

由于過(guò)氧化損傷可造成心肌細(xì)胞的脂膜損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)富含的氧化酶類外漏，因此心肌細(xì)胞培養(yǎng)液之中的LDH作為衡量心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的有效指標(biāo)，可反映心肌細(xì)胞細(xì)胞膜因脂質(zhì)過(guò)氧化作用而受損的情況。模型組的LDH含量明顯增高，說(shuō)明心肌細(xì)胞的線粒體膜在受損之后已發(fā)生崩解導(dǎo)致LDH外漏。而藥物保護(hù)組（維生素E）LDH濃度明顯減低，說(shuō)明維生素E可以減輕線粒體膜的崩解程度，對(duì)阿霉素造成的心肌氧化損傷有保護(hù)作用。

NOS是另一種衡量心肌細(xì)胞代謝狀態(tài)的有效指標(biāo)，可由阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶（NOS）可使細(xì)胞產(chǎn)生NO增加，與阿霉素致心肌細(xì)胞產(chǎn)生增加的O2－反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO－）。ONOO－是一種強(qiáng)氧化劑，可迅速分解為高活性的OH－和NO等自由基，參與脂質(zhì)過(guò)氧化。本實(shí)驗(yàn)中，損傷模型組的NOS含量高于空白對(duì)照組，說(shuō)明損傷模型組心肌細(xì)胞受阿霉素氧化損傷后被誘導(dǎo)產(chǎn)生較多NOS。而在藥物保護(hù)保護(hù)組，該指標(biāo)明顯較低，表示維生素E能夠有效的抑制NOS的誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而防止產(chǎn)生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，有效的保護(hù)了心肌細(xì)胞。

質(zhì)膜上的脂肪酸會(huì)在自由基的作用之下產(chǎn)生丙二醛（MDA）等產(chǎn)物，且丙二醛的含量和受損程度相關(guān)，因此MDA含量能間接的反映細(xì)胞受損的程度。模型組的MDA含量要比空白對(duì)照組明顯增高，說(shuō)明模型組細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷之后產(chǎn)生MDA。藥物保護(hù)組的MDA含量較模型組明顯下降，說(shuō)明維生素E作為生物體內(nèi)常見的還原劑，可以有效的阻礙自由基對(duì)不飽和脂肪酸的進(jìn)攻，從而減少M(fèi)DA的產(chǎn)生。

本研究顯示維生素E分別從線粒體膜的崩解、自由基誘導(dǎo)生成、不飽和脂肪酸被氧化的三個(gè)方面發(fā)揮作用，有效地減輕ADM引起的心肌細(xì)胞損傷、保存細(xì)胞活力、維持相對(duì)規(guī)律的心肌搏動(dòng)，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。因此維生素E在減輕阿霉素等蒽環(huán)類藥物的心臟毒性作用，提高化療期癌癥病人的生存質(zhì)量上有較大的應(yīng)用價(jià)值。

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［4］陳立娟，郭家彬，彭雙清，等.阿霉素致大鼠心臟氧化損傷及其機(jī)制的研究［J］.毒理學(xué)雜志，2006，20，（3）147.

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