周曉丹 李 越 陳曉慧 張佳寧 于殿宇

超臨界體系脂肪酶膜催化合成甘油二酯的研究

周曉丹 李 越 陳曉慧 張佳寧 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

以醋酸纖維素和聚四氟乙烯為材料制備醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜，采用吸附－交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法，用該復(fù)合膜固定化脂肪酶。并研究了在超臨界CO2狀態(tài)下，采用該固定化脂肪酶膜催化一級大豆油與甘油反應(yīng)合成甘油二酯的工藝，以反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯的含量為指標(biāo)，通過單因素與響應(yīng)面法進(jìn)行分析，確定最佳的工藝條件為:一級大豆油與甘油的物質(zhì)的量比為2∶1，反應(yīng)溫度為64℃，時間為7 h，加酶量為3．2%，甘油含水量為1%。在此條件下，得到反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66．3%。

超臨界CO2 脂肪酶膜 甘油解 甘油二酯

甘油二酯(DAG)，由甘油和2個脂肪酸酯化后得到，是油脂的天然成分。近年來發(fā)現(xiàn)，膳食甘油二酯具有減少內(nèi)臟脂肪、抑制體重增加、降低血脂等生理功能［1］。甘油二酯還可作為多功能添加劑，應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)。

甘油二酯的獲得主要有化學(xué)法和酶法2種。早期甘油二酯的生產(chǎn)多采用化學(xué)法，但反應(yīng)專一性差、產(chǎn)物得率低，而且高溫也影響產(chǎn)品的質(zhì)量［2－3］。采用酶法催化合成甘油二酯工藝的條件溫和、生產(chǎn)得率高、環(huán)保性好，是最有應(yīng)用前景的生產(chǎn)工藝。然而卻未能投入工業(yè)化生產(chǎn)，是由于酶的價格昂貴，相對于化學(xué)催化劑活性較低;隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶容易失活，導(dǎo)致使用次數(shù)降低，成本提高［4］。而以醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜為載體的固定化脂肪酶具有化學(xué)穩(wěn)定性好、機(jī)械性能強等優(yōu)點，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，有利于酶的分散、回收和再利用［5－6］。

目前，國內(nèi)外甘油二酯的制備多以酶催化法合成，該法在有機(jī)溶劑和無溶劑中反應(yīng)都取得了較好進(jìn)展［7］，但在超臨界體系下固定化酶法催化合成甘油二酯的相關(guān)報道較少。在超臨界狀態(tài)下二氧化碳流體具有類似于液體的密度和氣體的擴(kuò)散性與黏度，可大大降低酶反應(yīng)過程的傳質(zhì)阻力，提高反應(yīng)速率，并且不存在溶劑殘留問題［8－9］。本試驗以大豆油和甘油為原料，對超臨界狀態(tài)下固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯進(jìn)行研究，探討了溫度、時間、底物物質(zhì)的量、加酶量和甘油含水量對產(chǎn)物中甘油二酯含量的影響，并對其中的3個關(guān)鍵因素進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

一級大豆油:黑龍江龍江福糧油有限公司提供;甘油(AR級):中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;脂肪酶Lipozyme RMIM:丹麥若維信公司;醋酸纖維素:北京惠寶聯(lián)化科技有限公司;聚四氟乙烯膜(平均孔徑0．1μm，厚度85μm):北京塑料研究所;4A型分子篩:中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;去離子水:娃哈哈集團(tuán)有限公司;乙醚、氫氧化鈉、95%乙醇、鹽酸、橄欖油等，均為分析純。

ML54電子分析天平、PHS－3C精密酸度計:梅特勒－托利多儀器有限公司;硅膠板、層析缸、手動薄層涂鋪器:上海信議儀器廠;高壓反應(yīng)釜:江蘇太倉市醫(yī)療器械廠;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市英峪高科儀器廠;DK－2000－IIIL恒溫水浴鍋、YHW1104遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱:天津北華儀器廠;LD4－2A低速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;HPLC:Waters公司;JJ－2組織搗碎勻漿機(jī):蘇州江東精密儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 復(fù)合膜的制備

將15 g醋酸纖維素60℃下溶于85 g二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0．1 mol/L的NaOH溶液和0．1 mol/L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，干燥后平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下?lián)]發(fā)完成干相轉(zhuǎn)換后，浸入去離子水完成濕相轉(zhuǎn)換。12 h后用去離子水清洗，自然干燥待用。

1．2．2 脂肪酶的固定化

取若干份1 cm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和pH 7．5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫攪拌吸附2 h(25℃，170 r/min)。再加入0．2%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出脂肪酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待用。

1．2．3 酶活力的測定

采用橄欖油乳化法［10］。固定化酶活定義為:每平方厘米固定化酶膜在37℃，pH 7．5條件下，水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μmol的脂肪酸所消耗的酶量為一個酶活單位，用U/cm2表示。經(jīng)測定固定化脂肪酶膜活力為17．2 U/cm2。

1．2．4 脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)

將一級大豆油10 g，經(jīng)分子篩脫水后的甘油2 g，以一定的物質(zhì)的量比加入到高壓反應(yīng)釜中，添加一定量的脂肪酶膜后快速攪拌，加入1%的水，密封高壓釜，通入CO2試漏，再用CO2置換高壓反應(yīng)釜中的空氣。置換完成后，在室溫條件下充入CO2使壓力達(dá)到7．5 MPa，再將反應(yīng)釜置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中加熱，調(diào)節(jié)一定的轉(zhuǎn)速，恒溫反應(yīng)一段時間。反應(yīng)結(jié)束后，將高壓反應(yīng)釜冷卻至室溫，放出氣體，打開高壓釜，取出流體物，離心分離除去催化劑，得反應(yīng)產(chǎn)物，再將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行液相測定，得出甘油二酯占反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。1．2．5 甘油二酯含量的計算

取薄層顯色效果好的反應(yīng)產(chǎn)物1滴，準(zhǔn)確稱量，用1 mL正己烷/異丙醇50∶1溶解，進(jìn)樣分析。色譜條件:色譜柱:No－va－Pak 3．9 mm×150 mm液相色譜柱;主機(jī)泵:Waters515 HPLC Pump;檢測器:Waters 2410示差折光檢測器。流動相:正己烷/異丙醇為50∶1;流速:1．0 mL/min;檢測器溫度:35℃;柱箱溫度:35℃;進(jìn)樣量:20μL。

各組分的計算采用面積歸一法。

式中:w為甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù);m0、m1、m2和m3分別為脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯和三酰甘油的質(zhì)量?；旌细视王?biāo)準(zhǔn)樣品液相圖1，在1．932 min，溶劑峰;2．182 min，三酰甘油;2．348 min，脂肪酸;2．915 min，1，3－甘油二酯;3．932 min，1，2－甘油二酯;7．940 min，甘油一酯。

圖1 混合甘油酯標(biāo)準(zhǔn)樣品液相圖

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素試驗

2．1．1 溫度對脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)的影響

當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，時間7 h，加酶量3%時，分別選取反應(yīng)溫度為55、60、65、70、75℃，考察溫度對甘油解反應(yīng)中甘油二酯含量的影響。

圖2 溫度對甘油二酯含量的影響

由圖2可知，溫度從55℃升至65℃時，甘油二酯的含量逐漸上升，說明隨著溫度升高脂肪酶的催化活性部位逐漸暴露，發(fā)揮出較強的活力。當(dāng)溫度為65℃時，脂肪酶的催化活性達(dá)到極值。溫度高于65℃后，甘油二酯的含量開始下降，這可能是由于較高的反應(yīng)溫度，對酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象產(chǎn)生較大的影響，致使脂肪酶部分失活而引起的。因此，最適溫度為65℃。

2．1．2 時間對脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)的影響

當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，溫度65℃，加酶量3%時，分別選取反應(yīng)時間為5、6、7、8、9 h，考察時間對甘油解反應(yīng)中甘油二酯含量的影響。

圖3 時間對甘油二酯含量的影響

由圖3可知:隨著反應(yīng)時間的延長，甘油二酯的含量不斷提高，當(dāng)時間達(dá)到7 h后上升趨勢并不顯著，這是因為隨著反應(yīng)時間的延長，底物濃度和酶活力開始下降，甘油二酯含量的增加趨于平緩，體系基本達(dá)到平衡。另外，時間過長也會影響經(jīng)濟(jì)效益。因此，最適時間為7 h。

2．1．3 底物物質(zhì)的量比對脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)的影響

當(dāng)甘油含水量1%，溫度65℃，時間7 h，加酶量3%時，分別選取底物物質(zhì)的量比為1∶1、1．5∶1、2∶1、2．5∶1、3∶1，考察底物比對甘油解反應(yīng)中甘油二酯含量的影響。

圖4 底物物質(zhì)的量比對甘油二酯含量的影響

由圖4可知:甘油二酯的含量隨著底物物質(zhì)的量比的增加而逐漸上升，并在底物物質(zhì)的量比為2∶1時達(dá)到最大，而后開始下降。這是因為反應(yīng)達(dá)到平衡后產(chǎn)物的組成與底物比有關(guān)，底物比的增加，有利于副產(chǎn)物三酰甘油和甘油一酯的生成，從而使甘油二酯的含量降低［11］。因此，最適的底物物質(zhì)的量比為2∶1。

2．1．4 加酶量對脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)的影響

當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，甘油含水量1%，溫度65℃，時間7 h時，分別選取加酶量為2．0%、2．5%、3．0%、3．5%、4．0%，考察加酶量對甘油解反應(yīng)中甘油二酯含量的影響。

圖5 加酶量對甘油二酯含量的影響

由圖5可知:隨著酶用量的增加甘油二酯的含量也隨之提高，但當(dāng)加酶量達(dá)到3%以上時，甘油二酯含量的增加趨勢并不明顯。這是因為酶用量的變化與反應(yīng)速度密切相關(guān)，酶量增加，甘油解速度加快，但過多的酶會使體系形成少量糊狀物，導(dǎo)致分離困難，在實際生產(chǎn)中，也會導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。因此，最適的加酶量為3%。

2．1．5 甘油含水量對脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)的影響

當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量比2∶1，加酶量3%，溫度65℃，時間7 h時，分別選取甘油含水量0%、1%、2%、3%、4%，考察甘油含水量對甘油解反應(yīng)中甘油二酯含量的影響。

圖6 甘油含水量對甘油二酯含量的影響

由圖6可知:甘油含水量為1%時，甘油二酯的含量最高。之后隨著含水量增加，甘油二酯的含量呈下降趨勢，說明適宜的水分含量是維持酶活力所必須的，但當(dāng)超過一定量后，酶的酯化活力會大大降低，而表現(xiàn)為較高的水解活力［12］。因此，最適的甘油含水量為1%。

2．2 超臨界體系脂肪酶膜催化甘油解反應(yīng)條件的優(yōu)化

2．2．1 回歸方程的建立與分析

通過對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行分析后，選擇對底物物質(zhì)的量比、加酶量和反應(yīng)溫度這3個關(guān)鍵因素進(jìn)行進(jìn)一步考察。確定底物物質(zhì)的量比為2∶1，加酶量3%，溫度65℃，在此基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計(Box－Benhnken)，以底物比(A)、加酶量(B)和溫度(C)為自變量，甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(R1)為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗。自變量因素水平編碼見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果

通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(R1)對自變量底物比(A)、加酶量(B)和溫度(C)的回歸方程為:

運用Design Expert 7．0．0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0．000 1)失擬項不顯著(P＞0．05)，表中的B、C、A2、B2和C2為顯著影響因素，并且該模型R2=98．22%，R2Adj=95．92%，說明模型與試驗擬合良好，可以用于該反應(yīng)的理論推測。

表3 方差分析結(jié)果

2．2．2 底物物質(zhì)的量比和加酶量對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應(yīng)中的溫度固定在0水平上，可以得到底物物質(zhì)的量比和加酶量交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖7可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在底物物質(zhì)的量比約為2∶1，加酶量為3%～3．5%之間，甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在65%以上。

圖7 底物物質(zhì)的量比和加酶量對甘油二酯含量的影響

2．2．3 底物物質(zhì)的量比和溫度對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應(yīng)模型中的加酶量固定在0水平上，可以得到底物物質(zhì)的量比和溫度交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖8可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在底物物質(zhì)的量比約為2∶1，反應(yīng)溫度為62．5～65℃時，甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在65%以上。

圖8 底物物質(zhì)的量比和溫度對甘油二酯含量的影響

2．2．4 加酶量和溫度對甘油二酯含量的影響

將甘油解反應(yīng)模型中的底物物質(zhì)的量比固定在0水平上，可以得到加酶量與溫度交互作用對甘油二酯含量的影響。由圖9可知，甘油二酯含量的極值出現(xiàn)在試驗范圍內(nèi)，在加酶量為3%～3．5%之間，反應(yīng)溫度為62．5～65℃時，甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在65%以上。

圖9 加酶量和溫度對甘油二酯含量的影響

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

為檢驗響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，按照上述整理值進(jìn)行試驗，得到超臨界CO2體系固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66．3%。預(yù)測值與試驗值之間的良好擬合性證實了模型的有效性。表明所得的回歸方程可以很好的反映底物摩爾比、加酶量、溫度與甘油二酯含量的關(guān)系。應(yīng)用此方法優(yōu)化的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，在實踐中具有可行性。

3 結(jié)論

本研究確定了在超臨界CO2體系中以一級大豆油和甘油為原料，以固定化脂肪酶膜催化合成甘油二酯的工藝是可行的。通過單因素與響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定最佳的工藝條件為:底物物質(zhì)的量比為2∶1，反應(yīng)溫度64℃，時間7 h，加酶量3．2%，甘油含水量1%。最終得到反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66．3%。另外，固定化脂肪酶膜提高了酶在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性，有利于酶的分散、回收和再利用，為大規(guī)模生產(chǎn)甘油二酯的推廣提供了參考依據(jù)。

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Study on the Preparation of Diacylglycerol by Lipase Membrane Catalyzed in Supercritical System

Zhou Xiaodan Li Yue Chen Xiaohui Zhang Jianing Yu Dianyu
(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

CA－PTFE composite membranes were prepared by cellulose acetate(CA)and polytetrafluoroethylene(PTFE)with absorbing－crosslinking method．The CA－PTFE composite membrane was used for immobilizing lipase．The preparation of diacylglycerol by lipase Immobilized on membrane was catalyzed in Supercritical CO2system，this response was synthesized from first grade soybean oil and glycerin．According to the percentage composition of diacylglycerol，though the single factor and response surface，the optimum conditions were determine as follows:first grade soybean oil and glycerin molar ratio 2∶1，reaction temperature 64℃ ，time 7 h，the quantity of enzyme 3．2%，water content of glycerol 1%．Under these conditions，the content of diacylglycerol was 66．3%in the products．

supercritical CO2，lipase membrane，glycerolysis，diacylglycerol

TS229

A

1003－0174(2012)05－0050－06

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11551064)

2011－08－27

周曉丹，女，1987年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，博士，大豆油脂加工技術(shù)