楊旭 楊云鵬 馬英 周長青 張玉平 陳中美 彭國光

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易（Lewy）小體形成為特征。Lewy小體的主要成份是異常聚集的 α?突觸核蛋白（α?synuclein，α?syn）。 近年來的研究表明，α?syn 在 PD發(fā)病中起了極其重要作用［1］，α?syn蛋白異常聚集是PD病理和發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［2］，α?syn異常聚集可能通過誘導多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生凋亡這一機制參與 PD 的發(fā)生［3］，因此以 α?syn為靶點進行 PD防治研究是極具前景的研究方向［4-5］。我們課題組以降解和清除致病性異常聚集的α?syn蛋白，降低細胞免疫所引起的炎癥反應(yīng)為出發(fā)點，成功優(yōu)化構(gòu)建了人 α?syn（hα?syn）核酸疫苗（pVAX1?IL4／SYN?B），并在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達［6］。本研究旨在觀察hα?syn 核酸疫苗（pVAX1?IL4／SYN?B）免疫對魚藤酮慢性PD小鼠行為學和神經(jīng)病理改變的影響，以及神經(jīng)保護作用和治療效果，為今后進一步探索核酸疫苗防治PD的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人 α?syn 質(zhì)粒疫苗pVAX1?IL?4／SYN?B核酸疫苗是由帶有細胞因子IL?4及剔除了T細胞表位、然后將B細胞表位融合而得的真核表達載體，已經(jīng)由本實驗室成功構(gòu)建和制備，真核表達載體pVAX1是由Invitrogen公司購進，大腸桿菌TOP10是本實驗室保存的宿主菌。

1.1.2 實驗動物 清潔級C57BL／6小鼠，健康雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。喂養(yǎng)條件：每日光照12 h，黑暗12 h，室溫設(shè)為常溫，任意攝取水食。實驗全過程對動物的喂養(yǎng)與取材均遵守實驗動物管理與保護的有關(guān)政策和規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的大量制備及純化 首先按照GenE?lute HP去內(nèi)毒素核酸大量純化試劑盒 （Sigma，美國）說明書的步驟，抽提去內(nèi)毒素質(zhì)粒的pVAX1和 pVAX1?IL?4／SYN?B 兩種質(zhì)粒，然后用分光光度計測定A260／A280的比值。A260／A280全在1.8-2.0之間，為純度符合要求。最后用無菌去離子水稀釋，配伍成濃度為 1 μg／1 μL。 貯于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 魚藤酮慢性帕金森病小鼠模型的建立 參考萬金城等［7］文獻的模型制作魚藤酮慢性帕金森病小鼠模型，取所有健康雄性C57BL小鼠背部皮下注射魚藤酮（Sigma，美國）1mg／kg（配制方法∶二甲基亞砜∶魚藤酮∶生理鹽水 =3.5 L∶1 g∶0.5 L），1 次 ／d，連續(xù)地注射 40 d。

1.2.3 實驗動物的免疫接種 造模成功后的小鼠隨機分為核酸疫苗組、空質(zhì)粒組、PBS對照組共3組分別進行疫苗注射。所有模型動物在每次治療前均在雙側(cè)后肢脛骨前肌部位進行分別注射0.5%布比卡因 50 μL，于注射72 h后，分別對應(yīng)在各組小鼠同樣深度同樣部位多點注射 pVAX1?IL?4／SYN?B、空質(zhì)粒 pVAX1、 PBS 溶液各 100 μL，共 3次，每次間隔3周。

1.2.4 觀察小鼠行為學的變化 采用自由活動實驗（Open?fild test）［8］密切觀察各組小鼠疫苗注射后行為學的變化。自制透明玻璃箱30 cm×30 cm×15 cm，箱底劃為6 cm×6 cm的格子，在安靜光線較暗的環(huán)境中檢測。小鼠適應(yīng)環(huán)境10 min后，計數(shù)5 min內(nèi)小鼠移動的格子數(shù)和站立的次數(shù)，連續(xù)測5次取平均值。

1.2.5 小鼠中腦黑質(zhì) α?syn和 TH變化的觀察常規(guī)蠟片脫蠟至水，微波熱修復抗原后，PBS沖洗，3%的H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗，正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min；相繼滴加特異性第一抗體 ：α-syn 一抗（abcam）1∶250 稀釋，TH一抗（北京博奧森試劑）1∶100稀釋 ，然后過夜；第二天復溫1 h，PBS沖洗后滴加生物素標記的山羊抗兔 IgG二抗工作液，37℃水浴孵育 15 min；PBS沖洗后再滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃孵育 15 min；然后 PBS沖洗，進行 3，3－二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分色。梯度脫水和酒精透明，最后封片。采用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析，進行黑質(zhì)致密部α-syn積分光密度值（integral optical density）的測量及計數(shù)黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.6 RT-PCR檢測黑質(zhì) α-syn的表達 按 Trizol試劑盒 （TaKaRa公司）說明書提取小鼠腦黑質(zhì)總RNA，進行分光光度計鑒定RNA樣品，按照RTPCR試劑盒說明書在PCR儀（美國Bio-Rad）上進行RT-PCR。RT的反應(yīng)條件設(shè)為30℃10 min，85℃15 s。GAPDH 引物：下游 5′-GTGGAAGAATGGGAG T TGCTGT3′，上游 5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG TCT3′，擴增產(chǎn)物為 610 bp；α-syn 引物：下游 5′-AG GCTCATAGTCTTGGTAGC-3′，上游 5′-CATGAAAG GACTTTCAAAGG-3′，擴增產(chǎn)物為 403 bp；；反應(yīng)的條件：預(yù)變性溫度為94℃5 min；變性溫度為94℃，進行30 s退火溫度為56℃，進行30 s，延伸溫度為72℃，進行 60 s，一共30個循環(huán)；最后 72℃再延伸7 min。采用Quantityone4.6圖像分析軟件進行照相分析。每個條帶的相對光密度值為目的條帶光密度值／內(nèi)參GAPDH條帶光密度值。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 16.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用（）表示，多組間比較先進行方差齊性檢驗，若方差齊者進行方差分析，若方差不齊者進行秩和檢驗，兩組比較進行LSD-t檢驗。檢驗水率α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察 與對照組比較而言 ，核酸疫苗組小鼠的對外界刺激反應(yīng)慢，自發(fā)性活動減少，爬行活動減慢，體重減輕等類帕金森病癥狀改善；核酸疫苗組與空質(zhì)粒組及PBS對照組相比其自由活動移動格子數(shù)及站立次數(shù)明顯改善，并有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），然而空質(zhì)粒組及 PBS對照組比較無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05，見表 1）。

2.2 免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1 中腦黑質(zhì) TH陽性細胞的改變 空質(zhì)粒組和PBS對照組中腦黑質(zhì)TH陽性細胞質(zhì)染色較淺，突起較少，細胞數(shù)明顯減少，兩組間沒有統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），核酸疫苗組較空質(zhì)粒組和PBS對照組TH陽性細胞增多，染色加深；TH陽性細胞數(shù)比空質(zhì)粒組、PBS對照組增加了51.43%、59.00%，且有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，見表2及圖 1）。

2.2.2 中腦黑質(zhì) α-syn表達的改變 各組小鼠黑質(zhì)均可見深染，棕黃色的α-syn陽性表達。核酸疫苗組與空質(zhì)粒組及PBS對照組比較，首先小鼠中腦黑質(zhì)部α-syn陽性神經(jīng)突起染色較淡，其次積分吸光度值減少45.64%、43.28%，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而空質(zhì)粒組及PBS對照組中腦黑質(zhì)部α-syn的積分吸光度值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這就充分表明核酸疫苗組α-syn表達較對照組有所減少（見表2及圖2）。

表1 核酸疫苗組與對照組小鼠行為學評價

表2 核酸疫苗組與對照組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)及α－突觸核蛋白的積分吸光度值改變

圖1 小鼠黑質(zhì)部位TH免疫組織化學染色（400×）

圖2 小鼠黑質(zhì)部位α?syn免疫組織化學染色（400×）

圖3 小鼠腦黑質(zhì)α?syn的 mRNA表達

2.3 RT-PCR檢測α-syn mRNA的表達 核酸疫苗組小鼠中腦黑質(zhì)致密部α?syn mRNA表達水平（0.37±0.17）較空質(zhì)粒組（0.80±0.01）及 PBS對照組（0.74±0.05）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？召|(zhì)粒組和PBS對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05，見圖 3）。

3 討論

實驗結(jié)果表明，pVAX1?IL?4 ／SYN?B 核酸疫苗能改善帕金森病小鼠行為學癥狀，減輕魚藤酮神經(jīng)毒素對多巴胺神經(jīng)元的損害和阻止多巴胺神經(jīng)元的進一步損害，有效清除異常聚集的α?syn，起到神經(jīng)保護作用。

萬金城等［7］研究證實，慢性魚藤酮中毒可誘導小鼠發(fā)生PD樣行為學和病理學改變，導致中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元減少，α?syn表達增高和聚集。本研究采用 pVAX1?IL4／SYN?B核酸疫苗免疫魚藤酮慢性帕金森病小鼠，結(jié)果顯示核酸疫苗組與空質(zhì)粒組及PBS對照組比較，小鼠中腦黑質(zhì)部α?syn積分吸光度值減少 45.64%、43.28%，同時通過RT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)核酸疫苗組小鼠中腦黑質(zhì)致密部α?syn mRNA表達水平較對照組明顯減少，這充分表明 pVAX1?IL?4／SYN?B 核酸疫苗可能通過增加α?syn的降解來有效清除α?syn的異常聚集。通過自由活動實驗觀察到，優(yōu)化人α?syn核酸疫苗能有效改善小鼠類帕金森病癥狀；而且核酸疫苗組小鼠黑質(zhì)TH陽性細胞數(shù)比空質(zhì)粒對照組、PBS對照組增加了51.43%、59.00%，這說明pVAX1?IL4／SYN?B核酸疫苗能阻止黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進一步損害。2005年，Masliah等［9］首次采用α?syn重組蛋白疫苗免疫帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠，產(chǎn)生抗體可通過溶酶體途徑清除α?syn，減少α?syn在DA能神經(jīng)元胞體和突觸的聚集。這與我們實驗一致。目前對α?syn降解的具體機制尚不清楚。

我們課題組先期實驗成功地構(gòu)建了hα?syn核酸疫苗 pVAX1?hαS1?140，并在哺乳動物體內(nèi)表達［10］。以后的試驗觀察到hα?syn核酸疫苗治療MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了較好療效，使α?syn蛋白表達減少約39%，TH陽性細胞數(shù)增多46%～55%［11］。但是免疫治療可能激發(fā)有害的炎癥反應(yīng)。正是考慮到核酸免疫治療可能帶來有害的炎癥反應(yīng)，為提高核酸疫苗的免疫原性，減輕或避免細胞免疫應(yīng)答，促進體液免疫，我們課題組對核酸疫苗進行了優(yōu)化，刪除α?synuclein基因中的毒性片段T細胞表位，同時加入細胞因子人 IL?4基因為免疫佐劑，構(gòu)建多表位核酸疫苗pVAX1?IL?4 ／SYN?B［6］。 趙臣勇等［12］的研究證實 pVAX1?IL?4／SYN?B可在一定程度上減輕小鼠黑質(zhì)部炎癥反應(yīng)，對多巴胺能神經(jīng)元有一定的保護作用。本實驗 pVAX1?IL?4／SYN?B 核酸疫苗對多巴胺能神經(jīng)元的保護程度及降解α?syn的能力優(yōu)于王少君等［12］的實驗，這是由于本實驗采用的優(yōu)化后的核酸疫苗在一定程度減少了免疫炎癥反應(yīng)，從而提高了其免疫作用。

總之，優(yōu)化 hα?syn 核酸疫苗（pVAX1?IL?4／SYN?B）能改善帕金森病小鼠行為學癥狀，減輕魚藤酮神經(jīng)毒素對多巴胺神經(jīng)元的損害，達到阻止多巴胺神經(jīng)元進一步損害的目的，清除異常聚集的α?syn起到神經(jīng)保護作用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。但是，如何在提高免疫效果的同時，進一步消除可能的炎性反應(yīng)，核酸疫苗清除異常聚集的α?syn的具體機制仍是我們今后的研究方向和重點。

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