郭二坤 郝亮 梁朝輝 申海龍 李玉萍 馬東進(jìn) 焦保華

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的 44.7%［1］，其惡性程度高，手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)，且致死、致殘率均較高，對(duì)患者生命及生活質(zhì)量造成極大威脅?；熓悄X膠質(zhì)瘤治療的重要補(bǔ)充，槲皮素作為一種黃酮類(lèi)化合物，多項(xiàng)研究［2－4］顯示槲皮素對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用，是目前最強(qiáng)的抗腫瘤藥物之一。增殖細(xì)胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增生的核蛋白，直接參與腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的DNA復(fù)制，能夠準(zhǔn)確有效的反映腫瘤細(xì)胞的增殖能力，在腫瘤增殖活性的研究中被廣泛應(yīng)用［5］。 國(guó)內(nèi)學(xué)者［6］有報(bào)道槲皮素對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞具有抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，但槲皮素對(duì)C6大鼠體內(nèi)腦膠質(zhì)瘤是否具有抑制增殖的作用？本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立C6大鼠腦膠質(zhì)瘤模型，探討槲皮素對(duì)C6大鼠腦膠質(zhì)瘤的抑瘤作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 雄性SD大鼠35只（河北醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心）；C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 （天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供）。藥品和試劑：槲皮素注射液（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）；順鉑（CDDP，山東齊魯制藥廠）；PCNA鼠抗 IgG單克隆抗體 （Santa Cruze公司）；MRI掃描儀（MiniMR?60實(shí)驗(yàn)動(dòng)物核磁共振成像儀，上海紐邁電子科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液制備 將大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞復(fù)蘇，加入含10%已滅活胎牛血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基（含 NaHCO32 g／L，青霉素 100 U／mL，鏈霉素 100 U／mL）中，將培養(yǎng)瓶放入含 5%CO2，37℃恒溫密閉細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取10 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6細(xì)胞，用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板光鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)濃度使毎10 μL含1×106個(gè)細(xì)胞，然后按1∶9加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)等滲鹽溶液，1 min內(nèi)確認(rèn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率＞95%。

1.3 大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的制作 鼠齡7周雄性大鼠，水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉，大鼠腦立體定向儀頭架固定頭部，兩耳針深入外耳道，剪去頭頂部毛發(fā)，消毒，鋪洞巾。剪開(kāi)頭皮，逐層暴露至顱骨，確定前囟位置。囟中點(diǎn)前1 mm，矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)3.0～3.5 mm，接種部位為大鼠右側(cè)尾狀核，自接種點(diǎn)垂直進(jìn)針，從接觸硬膜開(kāi)始計(jì)算，進(jìn)針深度約6 mm，后退1 mm，將微量注射器內(nèi)10 μL細(xì)胞懸液 （含有約1.0×106C6細(xì)胞），緩慢注入，拔針后用骨蠟封閉，逐層縫合頭皮。給予3 d含抗生素的飲用水預(yù)防感染。接種后10 d，行強(qiáng)化頭部MRI，確定是否有腫瘤形成。將荷瘤鼠隨機(jī)分3組：對(duì)照組，槲皮素組，順鉑組。分別給予以下處理：①對(duì)照組：腹腔內(nèi)注射二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）0.2 mL，生理鹽水1 mL，每日1次，共7次；②槲皮素組：每天腹腔內(nèi)注射槲皮素50 mg／kg，生理鹽水1 mL，每日1次，共7次；③順鉑組：腹腔內(nèi)注射DMSO 0.2 mL，順鉑1 mg／kg（溶于1 mL生理鹽水），每日1次，共7次。

1.4 抑瘤率的計(jì)算 每組大鼠行頭顱MRI檢查，記錄腫瘤體積。然后斷頭處死大鼠，切取腫瘤組織，4%多聚甲醛固定，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，按照公式計(jì)算各組抑瘤率。抑瘤率= （空白對(duì)照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）／空白對(duì)照組腫瘤體積 ×100%，抑瘤率≥30%為腫瘤對(duì)藥物敏感。其中腫瘤體積=a×b×π／6（a為測(cè)量的腫瘤短徑，b為腫瘤長(zhǎng)徑）。

1.5 HE染色觀察 腫瘤組織10%甲醛固定，常規(guī)包埋蠟塊，切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞數(shù)量、密度及壞死情況。

1.6 透射電鏡觀察 4%戊二醛固定腫瘤組織，逐步固定、漂洗、脫水干燥后，超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)。

1.7 免疫組化測(cè)定PCNA 常規(guī)包埋蠟塊，切片進(jìn)行免疫組化 SP法染色，一抗?jié)舛龋?∶100），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片，光鏡下觀察，結(jié)果以胞核或（和）胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性，光鏡高倍視野下（400×）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分率為PCNA標(biāo)記指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)、方差分析及兩兩比較SNK?q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢查水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤體積和抑瘤率的比較 實(shí)驗(yàn)中有3只大鼠死于腦出血，1例死因不詳，1例死于顱內(nèi)感染，模型建立成功率85.7%（30／35），對(duì)存活的30只荷瘤鼠隨機(jī)分為3組繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。槲皮素組、順鉑組及對(duì)照組腫瘤體積分別為 （59.6 ± 5.4）mm3，（66.2 ±5.9）mm3和（101.1 ± 9.6）mm3（圖 1），槲皮素組治療效果優(yōu)于順鉑組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=10.61，P＜0.01）。計(jì)算槲皮素組和順鉑組的抑瘤率分別為 41.3%和 34.8%，均 ＞30%，顯示腫瘤對(duì)兩種治療均敏感。

2.2 HE染色觀察 對(duì)照組C6膠質(zhì)瘤內(nèi)可見(jiàn)生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞密集成群，瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核大深染，核分裂像多見(jiàn)。順鉑治療組腫瘤細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組減少，圍繞增生小血管或壞死灶云集在一起呈花環(huán)狀。槲皮素組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密度較對(duì)照組降低，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核形態(tài)相對(duì)規(guī)則，有大片壞死，并可見(jiàn)核固縮的凋亡細(xì)胞（圖 2）。

2.3 透射電鏡觀察 對(duì)照組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞核呈不規(guī)則形狀，細(xì)胞核大，可見(jiàn)核切跡，細(xì)胞胞膜結(jié)構(gòu)完整。順鉑和槲皮素組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)趨邊聚集，排列于核膜內(nèi)側(cè)，呈早期凋亡改變，細(xì)胞胞膜結(jié)構(gòu)消失（圖3）。

2.4 免疫組化觀察 PCNA陽(yáng)性顆粒著色于細(xì)胞核，呈棕黃色。槲皮素組、順鉑組、對(duì)照組腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為 42.2% ± 5.1%，50.0% ± 6.7%，79.6%±8.6%，治療組與對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F ＝ 416.12，P ＜ 0.01），兩治療組間相比較，槲皮素組效果優(yōu)于順鉑組 （q ＝ 55.12，P ＜ 0.05）（圖4）。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，呈浸潤(rùn)性、擴(kuò)展性生長(zhǎng)，手術(shù)難以根除，且多數(shù)膠質(zhì)瘤對(duì)放射線不敏感，化療藥物又難以透過(guò)血腦屏障，目前尚缺乏滿意的治療手段，因此如何有效的控制甚至治愈膠質(zhì)瘤仍是亟待解決的難題。

槲皮素是一種常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物，具有清除自由基及通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)來(lái)減輕細(xì)胞氧化損傷的作用［7］。 國(guó)內(nèi)學(xué)者［8］發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)所造成的神經(jīng)元損傷能夠起到保護(hù)作用。研究者［2－4］發(fā)現(xiàn)槲皮素的抗腫瘤活性除基于上述機(jī)制之外，還參與基因表達(dá)、胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大及酶活性調(diào)節(jié)等諸多機(jī)制，從而達(dá)到抑瘤作用。而最近的研究發(fā)現(xiàn)［9］，槲皮素能夠減弱肝臟炎癥反應(yīng)，降低肝臟纖維化進(jìn)程及防治肝癌的發(fā)生具有重要作用，并發(fā)現(xiàn)這一機(jī)制可能與槲皮素能夠使雙調(diào)蛋白及／表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制失調(diào)有關(guān)。因此，發(fā)揮槲皮素潛在的抑瘤作用，成為人們進(jìn)行抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)課題。

圖1 經(jīng)頭顱MRI觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠腫瘤大小

圖2 各實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠HE染色比較（標(biāo)尺20 μm；HE 100×）

圖3 透射電鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠超微結(jié)構(gòu)

圖4 免疫組織化法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織PCNA表達(dá) （示陽(yáng)性物質(zhì)著色于細(xì)胞核，標(biāo)尺 20 μm；DAB顯色 ×100）

文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素可顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，槲皮素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)［10］。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)給予荷瘤鼠不同的干預(yù)措施，結(jié)果顯示治療組膠質(zhì)瘤體積較對(duì)照組顯著減小，電鏡及HE染色觀察到對(duì)照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞僅有輕度凋亡以及壞死，腫瘤細(xì)胞密集，增生毛細(xì)血管較多，而經(jīng)槲皮素和順鉑治療后，瘤細(xì)胞增殖受到抑制，瘤細(xì)胞密度減小，且出現(xiàn)多量的凋亡細(xì)胞，并可見(jiàn)大片狀壞死灶。這說(shuō)明了槲皮素對(duì)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)的確存在抑制作用，在那么，它是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用的？研究者將PCNA表達(dá)用于評(píng)估腦膠質(zhì)瘤增殖活性的研究，并發(fā)現(xiàn)隨病理分級(jí)的增加，PCNA陽(yáng)性表達(dá)率增高，表明PCNA的表達(dá)程度是評(píng)估腦膠質(zhì)瘤增殖活性及其惡性程度的良好指標(biāo)［11］。

另外，PCNA做為細(xì)胞周期內(nèi)源性組織標(biāo)記物，在正常腦組織中不表達(dá)，卻在膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)，能夠反映腫瘤細(xì)胞增殖活性，對(duì)分析判斷膠質(zhì)瘤增殖、分化及預(yù)后有重要意義［12］。因此，我們選取PCNA作為研究對(duì)象，對(duì)槲皮素抗腫瘤的可能作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果顯示經(jīng)槲皮素和順鉑治療后的膠質(zhì)瘤組織中PCNA表達(dá)明顯降低，槲皮素組療效優(yōu)于順鉑組，據(jù)此，我們可以推測(cè)槲皮素對(duì)大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的抑制作用可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用實(shí)現(xiàn)的，但槲皮素抗膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的確切靶點(diǎn)及其更深入的分子生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。

［1］王忠誠(chéng)，神經(jīng)外科學(xué)［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1998，391－396.

［2］Choi JA，Kim JY，Lee JY，et al.Induction of cell cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells by quercetin［J］.Int J Oncol，2001，19（4）：837－844.

［3］Fridrich D，Teller N，Esselen M，et al.Comparison of delphinidin，quercetin and （－ ）-epigallocatechin-3-gallate as inhibitors of the EGFR and ErbB2 receptor phosphorylation［J］.Mol Nutr Food Res，2008，52（7）：815－822.

［4］Jung JH，Lee JO，Kim JH，et al.Quercetin suppresses HeLa cell viability via AMPK induced HSP70 and EGFR down-regulation［J］.J Cell Physiol，2010，223（2）：408－414.

［5］龍江，朱賢立，楊志敏，等.PTEN／MMAC1基因表達(dá)與星形細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2004，19（5）：341－334

［6］周立祥，羅毅男，付雙林，等.槲皮素對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖調(diào)控的作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2006，32（2）：251－253.

［7］Mercer LD，Kelly BL，Horne MK，et al.Dietary polyphenols protect dopamine neurons from oxidative insults and apoptosis：investigations in primary rat mesencephalic cultures［J］.Biochem Pharmacol，2005，69（2）：339－345.

［8］李蜀渝，肖波，畢方方，等.槲皮素對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬XIAP mRNA與蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2008，34（9）：542－545.

［9］Cuevas MJ，Tieppo J，Marroni NP，et al.Suppression of Amphiregulin／EpidermalGrowth FactorReceptorSignalsContributes to the Protective Effects of Quercetin in Cirrhotic Rats［J］.J Nutr，2011，5（1）：1－7.

［10］楊洋，張蔚，黃麗瓊，等.槲皮素聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，30（3）：334－336.

［11］Kayaselcuk F，Zorludemir S，Gumurduhu D，et al.PCNA and Ki-67 in central nervous system tumors：correlation with the histological type and grade［J］.J Neurooncol，2002，57（2）：115－121.

［12］Marinovic J，Ljubkovic M，Stadnicka A，et al.Role of sarcolemmal ATP-sensitive potassium channel in oxidative stress induced apoptosis： mitochondrial connection［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294（3）：1317－1325.